Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
Toxoplasma gondii hujayra ichidagi protozoa paraziti bo'lib, infektsiyalangan xostning mikro muhitini modulyatsiya qiladi va miya shishi o'sishi bilan bog'liqligi ma'lum.Ushbu tadqiqotda biz toksoplazma infektsiyasidan olingan ekzosomal miRNK-21 miya shishi o'sishiga yordam beradi deb taxmin qilamiz.Toksoplazma bilan kasallangan BV2 mikrogliyasidan olingan ekzosomalar tavsiflandi va U87 glioma hujayralarining ichkilashtirilishi tasdiqlandi.Toxoplasma gondii va o'simtalarni saralash bilan bog'liq mikroRNK va mikroRNK-21A-5p massivlari yordamida ekzosomal mikroRNK ifoda profillari tahlil qilindi.Shuningdek, biz U87 glioma hujayralarida o'simta bilan bog'liq genlarning mRNK darajasini ekzosomalarda miR-21 darajasini va ekzosomalarning inson U87 glioma hujayralari proliferatsiyasiga ta'sirini o'zgartirib tekshirdik.Toxoplasma gondii bilan kasallangan U87 glioma hujayralarining ekzosomalarida mikroRNK-21 ekspressiyasi kuchayadi va o'smaga qarshi genlarning (FoxO1, PTEN va PDCD4) faolligi pasayadi.Toksoplazma bilan kasallangan BV2 dan olingan ekzosomalar U87 glioma hujayralarining ko'payishiga olib keladi.Ekzosomalar sichqon o'simtasi modelida U87 hujayralarining o'sishiga olib keladi.Biz toksoplazma bilan kasallangan BV2 mikrogliyasida ko'paygan ekzosomal miR-21 antitumor genlarini pastga tartibga solish orqali U87 glioma hujayralarida hujayra o'sishi promouteri sifatida muhim rol o'ynashini taklif qilamiz.
Hisob-kitoblarga ko'ra, 2018 yilda dunyo bo'ylab 18,1 milliondan ortiq rivojlangan saraton kasalligi tashxisi qo'yilgan, har yili 297 000 ga yaqin markaziy asab tizimining o'smasi (barcha o'smalarning 1,6%)1 tashxis qilinadi.Oldingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, inson miyasi o'smalari rivojlanishi uchun xavf omillari turli xil kimyoviy mahsulotlar, oila tarixi va bosh terapevtik va diagnostika uskunalaridan ionlashtiruvchi nurlanishni o'z ichiga oladi.Biroq, bu malign o'smalarning aniq sabablari noma'lum.Dunyo bo'ylab barcha saraton kasalliklarining taxminan 20 foizi yuqumli agentlar, shu jumladan viruslar, bakteriyalar va parazitlar tomonidan qo'zg'atiladi3,4.Yuqumli patogenlar xujayraning genetik mexanizmlarini, masalan, DNKni tiklash va hujayra siklini buzadi va surunkali yallig'lanish va immunitet tizimining shikastlanishiga olib kelishi mumkin5.
Inson saratoni bilan bog'liq yuqumli agentlar eng keng tarqalgan virusli patogenlar, shu jumladan inson papillomaviruslari va gepatit B va C viruslari.Parazitlar ham inson saratoni rivojlanishida potentsial rol o'ynashi mumkin.Bir necha parazit turlari, ya'ni Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis va Hymenolepis nana inson saratonining har xil turlarida ishtirok etgan 6,7,8.
Toxoplasma gondii - hujayra ichidagi protozoa bo'lib, infektsiyalangan xost hujayralarining mikro muhitini tartibga soladi.Ushbu parazit dunyo aholisining taxminan 30 foizini yuqtirgani taxmin qilinmoqda, bu esa butun aholini xavf ostiga qo'yadi9,10.Toxoplasma gondii hayotiy muhim organlarni, shu jumladan markaziy asab tizimini (CNS) yuqtirishi va o'limga olib keladigan meningit va ensefalit kabi jiddiy kasalliklarga olib kelishi mumkin, ayniqsa immuniteti zaif bemorlarda9.Shu bilan birga, Toxoplasma gondii immuniteti zaif odamlarda hujayra o'sishi va immun reaktsiyalarini modulyatsiya qilish orqali infektsiyalangan xostning muhitini o'zgartirishi mumkin, bu esa asemptomatik surunkali infektsiyaning saqlanishiga olib keladi9,11.Qizig'i shundaki, T. gondii tarqalishi va miya shishi bilan kasallanish o'rtasidagi bog'liqlikni hisobga olgan holda, ba'zi ma'lumotlarga ko'ra, surunkali T. gondii infektsiyasi tufayli in vivo mezbon atrof-muhit o'zgarishlari o'simta mikro muhitiga o'xshaydi.
Ekzosomalar qo'shni hujayralardan biologik tarkibni, shu jumladan oqsillar va nuklein kislotalarni etkazib beradigan hujayralararo kommunikatorlar sifatida tanilgan16,17.Ekzosomalar o'simta mikromuhitida antiapoptoz, angiogenez va metastaz kabi o'sma bilan bog'liq biologik jarayonlarga ta'sir qilishi mumkin.Xususan, miRNKlar (miRNKlar), uzunligi taxminan 22 nukleotid bo'lgan kichik kodlanmaydigan RNKlar, miRNK-induktsiyali susturucu kompleksi (miRISC) orqali inson mRNKsining 30% dan ko'prog'ini boshqaradigan muhim post-transkripsiya gen regulyatorlaridir.Toxoplasma gondii infektsiyalangan xostlarda miRNK ifodasini nazorat qilish orqali biologik jarayonlarni buzishi mumkin.Xost miRNKlari parazitning omon qolish strategiyasiga erishish uchun xost biologik jarayonlarini tartibga solish uchun muhim signallarni o'z ichiga oladi.Shunday qilib, T. gondii bilan infektsiyalanganda xost miRNK profilidagi o'zgarishlarni o'rganish bizga xost va T. gondii o'rtasidagi o'zaro ta'sirni aniqroq tushunishga yordam beradi.Haqiqatan ham, Thirugnanam va boshqalar.15 T. gondii o'simta o'sishi bilan bog'liq bo'lgan o'ziga xos xost miRNKlarida ifodasini o'zgartirib, miya karsinogenezini rag'batlantiradi, deb taklif qildi va T. gondii eksperimental hayvonlarda gliomalarni keltirib chiqarishi mumkinligini aniqladi.
Ushbu tadqiqot Toxoplasma BV2 bilan kasallangan mikrogliyada ekzosomal miR-21 ning o'zgarishiga qaratilgan.Biz o'zgartirilgan ekzosomal miR-21 ning U87 glioma hujayralarining o'sishida mumkin bo'lgan rolini kuzatdik, chunki u haddan tashqari ifodalangan miR-21 ning maqsadi bo'lgan FoxO1 / p27 yadrosida ushlab turilishi mumkin.
BV2 dan olingan ekzosomalar differentsial santrifüj yordamida olingan va hujayra komponentlari yoki boshqa pufakchalar bilan ifloslanishning oldini olish uchun turli usullar bilan tasdiqlangan.SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) BV2 xujayralari va ekzozomalardan olingan oqsillar o'rtasida aniq naqshlarni ko'rsatdi (1A-rasm) va namunalar Aliks borligi uchun baholandi, u .Aliks yorlig'i ekzozoma oqsillarida topilgan, ammo BV2 hujayra lizat oqsillarida topilmagan (1B-rasm).Bundan tashqari, BV2 dan olingan ekzozomalardan tozalangan RNK bioanalizator yordamida tahlil qilindi.18S va 28S ribosoma bo'linmalari ekzosomal RNK migratsiya naqshida kamdan-kam kuzatilgan, bu ishonchli tozalikni ko'rsatadi (1C-rasm).Nihoyat, transmissiya elektron mikroskopi kuzatilgan ekzosomalar taxminan 60-150 nm o'lchamda ekanligini va ekzozoma morfologiyasiga xos bo'lgan chashka o'xshash tuzilishga ega ekanligini ko'rsatdi (1D-rasm).
BV2 hujayralaridan olingan ekzozomalarning xarakteristikasi.(A) Xavfsizlik ma'lumotlar varag'i sahifasi.Proteinlar BV2 hujayralaridan yoki BV2 dan olingan ekzozomalardan ajratilgan.Protein naqshlari hujayralar va ekzosomalar orasida farq qiladi.(B) Ekzosomal markerning Western blot tahlili (Aliks).(C) BV2 hujayralari va BV2 olingan ekzosomalardan tozalangan RNKni bioanalizator yordamida baholash.Shunday qilib, BV2 hujayralarida 18S va 28S ribosoma bo'linmalari kamdan-kam hollarda ekzosomal RNKda topilgan.(D) Transmissiya elektron mikroskopi BV2 hujayralaridan ajratilgan ekzosomalar 2% uranil asetat bilan salbiy bo'yalganligini ko'rsatdi.Ekzosomalar taxminan 60-150 nm kattalikda va chashka shaklida (Song va Jung, nashr etilmagan ma'lumotlar).
BV2 dan olingan ekzosomalarning U87 inson glioma hujayralariga uyali ichkilashuvi konfokal mikroskop yordamida kuzatildi.PKH26 etiketli ekzosomalar U87 hujayralari sitoplazmasida joylashgan.Yadrolar DAPI bilan bo'yalgan (2A-rasm), bu BV2-dan olingan ekzosomalar xost hujayralari tomonidan ichkilashtirilishi va qabul qiluvchi hujayralar muhitiga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rsatadi.
BV2 dan olingan ekzosomalarning U87 glioma hujayralariga va Toksoplazma RH bilan kasallangan BV2 hosil bo'lgan ekzosomalarga ichkilashtirilishi U87 glioma hujayralarining proliferatsiyasini keltirib chiqardi.(A) Konfokal mikroskop bilan o'lchangan U87 hujayralari tomonidan yutilgan ekzosomalar.U87 glioma hujayralari PKH26 (qizil) bilan belgilangan ekzosomalar bilan yoki 24 soat davomida nazoratsiz inkubatsiya qilingan.Yadrolar DAPI (ko'k) bilan bo'yalgan va keyin konfokal mikroskop ostida kuzatilgan (shkala chizig'i: 10 mkm, x 3000).(B) U87 glioma hujayralari proliferatsiyasi hujayra proliferatsiyasi tahlili bilan aniqlandi.U87 glioma hujayralari ko'rsatilgan vaqt davomida ekzosomalar bilan davolandi. *P <0,05 Student t testi orqali olingan. *P <0,05 Student t testi orqali olingan. *P < 0,05 Styudentaning t-kriteriyu bo'yicha polucheno. * Talabaning t-testi bo'yicha P <0,05. *P < 0.05 língíngín t yàngíngjín *P <0,05 * P < 0,05, poluchennyy s pomoshchyu t-kriteriya Styudenta. * P <0,05 Student's t-test yordamida olingan.
BV2-dan olingan ekzosomalarning U87 glioma hujayralariga ichkilashtirilishini tasdiqlaganimizdan so'ng, biz BV2-dan olingan Toksoplazmadan olingan ekzosomalarning inson glioma hujayralari rivojlanishidagi rolini o'rganish uchun hujayra proliferatsiyasi tahlillarini o'tkazdik.U87 hujayralarini T. gondii bilan kasallangan BV2 hujayralaridan ekzosomalar bilan davolash shuni ko'rsatdiki, T. gondii bilan kasallangan BV2 hosil bo'lgan ekzosomalar nazorat bilan solishtirganda U87 hujayralarining sezilarli darajada yuqori proliferatsiyasiga sabab bo'lgan (2B-rasm).
Bundan tashqari, U118 hujayralarining o'sishi U87 bilan bir xil natijalarga erishdi, chunki toksoplazmani qo'zg'atgan ekzozomalar proliferatsiyaning eng yuqori darajasini keltirib chiqardi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).Ushbu ma'lumotlarga asoslanib, biz BV2 kelib chiqqan toksoplazma bilan kasallangan ekzosomalar glioma hujayralarining ko'payishida muhim rol o'ynashini ko'rsatishimiz mumkin.
Toksoplazma bilan kasallangan BV2 hosil bo'lgan ekzosomalarning o'simta rivojlanishiga ta'sirini o'rganish uchun biz U87 glioma hujayralarini ksenograft modeli uchun yalang'och sichqonlarga AOK qildik va BV2 yoki RH-infektsiyali BV2 ekzosomalarini AOK qildik.1 haftadan so'ng o'smalar paydo bo'lgandan so'ng, 5 sichqondan iborat har bir eksperimental guruh bir xil boshlang'ich nuqtasini aniqlash uchun o'simta hajmiga ko'ra bo'lingan va o'simta hajmi 22 kun davomida o'lchangan.
U87 ksenograft modeliga ega bo'lgan sichqonlarda 22-kuni BV2-dan olingan RH-infektsiyali ekzozoma guruhida sezilarli darajada kattaroq o'simta hajmi va vazni kuzatildi (3A, B-rasm).Boshqa tomondan, BV2 dan olingan ekzozoma guruhi va eksozoma davolashdan keyin nazorat guruhi o'rtasida o'simta hajmida sezilarli farq yo'q edi.Bundan tashqari, glioma hujayralari va ekzosomalar bilan AOK qilingan sichqonlar RH-infektsiyalangan BV2-dan olingan ekzosomalar guruhidagi eng katta o'simta hajmini vizual ravishda ko'rsatdi (3C-rasm).Ushbu natijalar BV2 dan olingan Toksoplazma bilan kasallangan ekzosomalar sichqon o'simtasi modelida glioma o'sishini keltirib chiqarishini ko'rsatadi.
U87 ksenograft sichqoncha modelida BV2-dan olingan ekzosomalarning onkogenezi (AC).BV2 dan olingan RH-infektsiyali ekzosomalar bilan davolash qilingan BALB / c yalang'och sichqonlarda o'simta hajmi (A) va vazni (B) sezilarli darajada oshdi.BALB/c yalang'och sichqonlari (C) Matrigel aralashmasida to'xtatilgan 1 x 107 U87 hujayralar bilan teri ostiga AOK qilindi.In'ektsiyadan olti kun o'tgach, sichqonlarda 100 mkg BV2 hosil bo'lgan ekzosomalar davolandi.Ko'rsatilgan kunlarda va qurbonlikdan keyin o'simta hajmi va vazni o'lchandi. *P <0,05. *P <0,05. *R < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *R < 0,05. *P <0,05.
Ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, immunitet yoki o'simta rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan 37 miRNK (16 ta haddan tashqari va 21 ta kamaytirilgan) Toxoplasma RH shtammi bilan infektsiyadan so'ng mikrogliyada sezilarli darajada o'zgargan (4A-rasm).O'zgartirilgan miRNKlar orasida miR-21 ning nisbiy ifoda darajalari BV2 dan olingan ekzozomalarda, BV2 va U87 hujayralari bilan ishlov berilgan ekzosomalarda real vaqt rejimida RT-PCR bilan tasdiqlangan.miR-21 ifodasi Toxoplasma gondii (RH shtammi) bilan kasallangan BV2 hujayralaridan ekzosomalar sezilarli darajada oshganini ko'rsatdi (4B-rasm).BV2 va U87 hujayralarida miR-21 ning nisbiy ifoda darajalari o'zgartirilgan ekzozomalarni qabul qilgandan keyin ortdi (4B-rasm).Toxoplasma gondii (ME49 shtammi) bilan kasallangan o'simtali bemorlar va sichqonlarning miya to'qimalarida miR-21 ifodasining nisbiy darajalari mos ravishda nazoratchilarga qaraganda yuqori edi (4C-rasm).Ushbu natijalar in vitro va in vivo prognoz qilingan va tasdiqlangan mikroRNKlarning ifoda darajalari o'rtasidagi farqlar bilan bog'liq.
Toxoplasma gondii (RH) bilan kasallangan mikrogliyada ekzosomal miP-21a-5p ifodasidagi o'zgarishlar.(A) T. gondii RH infektsiyasidan keyin immunitet yoki o'sma rivojlanishi bilan bog'liq siRNKda sezilarli o'zgarishlarni ko'rsatadi.(B) nisbiy miR-21 ifoda darajalari real vaqtda RT-PCR orqali BV2-dan olingan ekzosomalar, BV2-davolangan ekzosomalar va U87 hujayralarida aniqlandi.(C) MiR-21 nisbiy ifoda darajalari o'simtali bemorlarning (N = 3) va Toxoplasma gondii (ME49 shtammi) bilan kasallangan sichqonlarning miya to'qimalarida topilgan (N = 3). *P <0,05 Student t testi orqali olingan. *P <0,05 Student t testi orqali olingan. *P < 0,05 bylo polucheno s pomoshchyu t-kriteriya Styudenta. * P <0,05 Student t-testi yordamida olingan. *P < 0.05 língíngín t yàngíngjín *P <0,05 * P <0,05, poluchennyy s pomoshchyu t-kriteriya Styudenta. * P <0,05 Student's t-test yordamida olingan.
RH-infektsiyalangan BV2 hujayralaridan ekzosomalar in vivo va in vitro gliomalarning o'sishiga olib keldi (2, 3-rasm).Tegishli mRNKlarni aniqlash uchun biz BV2 yoki RH BV2 dan olingan ekzosomalar bilan kasallangan U87 hujayralarida antitumor maqsadli genlarning mRNK darajalarini, O1 (FoxO1), PTEN va dasturlashtirilgan hujayra o'limi 4 (PDCD4) ni tekshirdik.Bioinformatika tahlili shuni ko'rsatdiki, bir nechta o'simta bilan bog'liq genlar, shu jumladan FoxO1, PTEN va PDCD4 genlari miR-2121,22 bog'lanish joylariga ega.Antitumor maqsadli genlarning mRNK darajalari RH-infektsiyalangan BV2-dan olingan ekzozomalarda BV2-dan olingan ekzozomalarga nisbatan kamaydi (5A-rasm).FoxO1, BV2 hosil bo'lgan ekzosomalar bilan solishtirganda, RH-infektsiyalangan BV2-dan olingan ekzosomalarda oqsil darajasining kamayganligini ko'rsatdi (5B-rasm).Ushbu natijalarga asoslanib, biz RH-infektsiyalangan BV2 dan olingan ekzosomalar o'simta o'sishidagi rolini saqlab, anti-onkogen genlarni pastga tushirishini tasdiqlashimiz mumkin.
Toksoplazma RH-infektsiyalangan BV2-dan kelib chiqqan ekzosomalar U87 glioma hujayralarida toksoplazma RH-infektsiyali BV2-oluvchi ekzosomalar tomonidan antitumor genlarini bostirishga olib keladi.(A) PBS eksozomalariga nisbatan T. gondii RH-infektsiyali BV2 dan olingan ekzozomalarda FoxO1, PTEN va PDCD4 ifodasining real vaqtda PCR.Nazorat sifatida b-aktin mRNK ishlatilgan.(B) FoxO1 ifodasi Western blotting tomonidan aniqlandi va densitometriya ma'lumotlari ImageJ dasturi yordamida statistik baholandi. *P <0,05 Student t testi orqali olingan. *P <0,05 Student t testi orqali olingan. *P < 0,05 bylo polucheno s pomoshchyu t-kriteriya Styudenta. * P <0,05 Student t-testi yordamida olingan. *P < 0.05 língíngín t yàngíngjín *P <0,05 * P <0,05, poluchennyy s pomoshchyu t-kriteriya Styudenta. * P <0,05 Student's t-test yordamida olingan.
Ekzosomalardagi miP-21 ning o'simta bilan bog'liq gen tartibga solishga ta'sirini tushunish uchun U87 hujayralari Lipofektamin 2000 yordamida miP-21 inhibitori bilan transfektsiya qilindi va hujayralar transfeksiyadan 24 soat o'tgach yig'ib olindi.MiR-21 ingibitorlari bilan transfektsion hujayralardagi FoxO1 va p27 ifoda darajalari qRT-PCR yordamida BV2 dan olingan ekzosomalar bilan ishlov berilgan hujayralar bilan solishtirildi (6A, B-rasm).MiR-21 inhibitörünün U87 hujayralariga transfeksiyasi FoxO1 va p27 ifodasini sezilarli darajada pasaytirdi (6-rasm).
RH-infektsiyalangan ekzosomal BV2-dan olingan miP-21, U87 glioma hujayralarida FoxO1 / p27 ifodasini o'zgartirdi.U87 hujayralari Lipofektamin 2000 yordamida miP-21 inhibitori bilan transfektsiya qilindi va hujayralar transfeksiyadan 24 soat o'tgach yig'ib olindi.MiR-21 ingibitorlari bilan transfektsiyalangan hujayralardagi FoxO1 va p27 ifoda darajalari qRT-PCR (A, B) yordamida BV2 dan olingan ekzosomalar bilan ishlov berilgan hujayralardagi darajalar bilan solishtirildi.
Xostning immun javobidan qochish uchun Toksoplazma paraziti to'qima kistasiga aylanadi.Ular uy egasining butun umri davomida turli to'qimalarda, jumladan, miya, yurak va skelet mushaklarida parazitlik qiladi va uy egasining immun reaktsiyasini modulyatsiya qiladi.Bundan tashqari, ular hujayra siklini va xost hujayralarining apoptozini tartibga solib, ularning ko'payishiga yordam beradi14,24.Toxoplasma gondii asosan mezbon dendritik hujayralar, neytrofillar va monositlar/makrofaglar nasl-nasabini, shu jumladan miya mikrogliyasini yuqtiradi.Toxoplasma gondii M2 fenotipidagi makrofaglarning differentsiatsiyasini keltirib chiqaradi, patogen infektsiyadan keyin jarohatni davolashga ta'sir qiladi, shuningdek, gipervaskulyarizatsiya va granulomatoz fibroz bilan bog'liq.Toksoplazma infektsiyasining bu xulq-atvori patogenezi o'sma rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan belgilar bilan bog'liq bo'lishi mumkin.Toksoplazma tomonidan tartibga solinadigan dushman muhit tegishli prekanserga o'xshash bo'lishi mumkin.Shuning uchun, Toksoplazma infektsiyasi miya shishi rivojlanishiga hissa qo'shishi kerak deb taxmin qilish mumkin.Aslida, turli xil miya shishi bo'lgan bemorlarning zardobida Toksoplazma infektsiyasining yuqori darajasi qayd etilgan.Bundan tashqari, Toxoplasma gondii boshqa kanserogen effektor bo'lishi mumkin va boshqa yuqumli kanserogenlarga miya shishi rivojlanishiga yordam berish uchun sinergik harakat qiladi.Shu munosabat bilan shuni ta'kidlash kerakki, P. falciparum va Epstein-Barr virusi Burkitt limfomasining shakllanishiga sinergik hissa qo'shadi.
Saraton tadqiqotlari sohasida ekzosomalarning regulyator sifatidagi roli keng qamrovli o'rganilgan.Biroq, parazitlar va infektsiyalangan xostlar o'rtasidagi ekzosomalarning roli hali ham yaxshi tushunilmagan.Hozirgacha turli regulyatorlar, jumladan, ajratilgan oqsillar, protozoa parazitlari xost hujumiga qarshi turish va infektsiyani davom ettirish biologik jarayonlarini tushuntirib berdi.So'nggi paytlarda protozoa bilan bog'langan mikrovesikullar va ularning mikroRNKlari ularning yashashi uchun qulay muhit yaratish uchun xost hujayralari bilan o'zaro ta'sir qiladi, degan tushuncha o'sib bormoqda.Shuning uchun o'zgartirilgan ekzosomal miRNKlar va glioma hujayralari proliferatsiyasi o'rtasidagi bog'liqlikni aniqlash uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi.MikroRNK o'zgarishi (klaster genlari miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 va miR-17-92) toksoplazma bilan kasallangan inson makrofaglarida STAT3 promouteriga bog'lanadi, tartibga solinadi va antiinduktsiyani keltirib chiqaradi. -Toxoplasma gondii infektsiyasiga javoban apoptoz 29 .Toksoplazma infektsiyasi miR-17-5p va miR-106b-5p ifodasini oshiradi, ular bir nechta giperproliferativ kasalliklar 30 bilan bog'liq.Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, toksoplazma infektsiyasi bilan tartibga solinadigan mezbon miRNKlar parazitlarning omon qolishi va xost biologik xatti-harakatlarida patogenez uchun muhim molekulalardir.
O'zgartirilgan miRNKlar malign hujayralar, shu jumladan gliomalar boshlanishi va rivojlanishi paytida xatti-harakatlarning har xil turlariga ta'sir qilishi mumkin: o'sish signallarining o'z-o'zini ta'minlashi, o'sishni inhibe qiluvchi signallarga befarqligi, apoptozdan qochish, cheksiz replikativ potentsial, angiogenez, invaziya va metastaz va yallig'lanish.Gliomada o'zgartirilgan miRNKlar bir nechta ekspress profilini o'rganishda aniqlangan.
Ushbu tadqiqotda biz toksoplazma bilan kasallangan xost hujayralarida miRNK-21 ifodasining yuqori darajasini tasdiqladik.miR-21 qattiq o'smalarda, shu jumladan gliomalarda, 33da tez-tez haddan tashqari ifodalangan mikroRNKlardan biri sifatida aniqlangan va uning ifodasi glioma darajasiga mos keladi.To'plangan dalillar shuni ko'rsatadiki, miR-21 yangi onkogen bo'lib, u glioma o'sishida anti-apoptotik omil bo'lib ishlaydi va inson miyasi malign o'smalarining to'qimalari va plazmasida haddan tashqari ko'p ifodalanadi.Qizig'i shundaki, glioma hujayralari va to'qimalarida miR-21 inaktivatsiyasi kaspazaga bog'liq apoptoz tufayli hujayra proliferatsiyasini inhibe qiladi.MiR-21 prognoz qilingan maqsadlarning bioinformatik tahlili apoptoz yo'llari bilan bog'liq bo'lgan bir nechta o'simta bostiruvchi genlarni aniqladi, shu jumladan dasturlashtirilgan hujayra o'limi 4 (PDCD4), tropomiyozin (TPM1), PTEN va miR-2121 bog'lanish joyi bilan vilkalar qutisi O1 (FoxO1)..22.38.
FoxO1 transkripsiya omillaridan biri (FoxO) sifatida inson saratonining turli turlarini rivojlanishida ishtirok etadi va p21, p27, Bim va FasL40 kabi o'simtani bostiruvchi genlarning ifodasini tartibga solishi mumkin.FoxO1 hujayra o'sishini bostirish uchun p27 kabi hujayra sikli inhibitörlerini bog'lashi va faollashtirishi mumkin.Bundan tashqari, FoxO1 PI3K/Akt signalizatsiyasining asosiy effektoridir va p2742 transkripsiyasini faollashtirish orqali hujayra siklining rivojlanishi va hujayra differentsiatsiyasi kabi ko'plab biologik jarayonlarni tartibga soladi.
Xulosa qilib aytganda, biz toksoplazma bilan kasallangan mikrogliyadan olingan ekzosomal miR-21 glioma hujayralarining o'sish regulyatori sifatida muhim rol o'ynashi mumkinligiga ishonamiz (7-rasm).Biroq, ekzosomal miR-21, o'zgargan toksoplazma infektsiyasi va glioma o'sishi o'rtasidagi to'g'ridan-to'g'ri aloqani topish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi.Ushbu natijalar toksoplazma infektsiyasi va glioma bilan kasallanish o'rtasidagi munosabatni o'rganish uchun boshlang'ich nuqta bo'lishi kutilmoqda.
Ushbu tadqiqotda glioma (miya) kanserogenezi mexanizmining sxematik diagrammasi taklif qilingan.Muallif PowerPoint 2019 da (Microsoft, Redmond, WA) chizadi.
Ushbu tadqiqotdagi barcha eksperimental protokollar, shu jumladan hayvonlardan foydalanish, Seul Milliy Universiteti Hayvonlarni parvarish qilish va foydalanuvchi qo'mitasining standart axloqiy yo'riqnomalariga muvofiq edi va Seul Milliy Universiteti Tibbiyot fakulteti institutsional tekshiruv kengashi tomonidan tasdiqlangan (IRB raqami SNU- 150715).-2).Barcha eksperimental protseduralar ARRIVE tavsiyalariga muvofiq amalga oshirildi.
BV2 sichqoncha mikrogliyasi va U87 inson glioma hujayralari mos ravishda Dulbekko modifikatsiyalangan burgut muhitida (DMEM; Welgene, Seul, Koreya) va Roswell Park memorial instituti muhitida (RPMI; Welgene) yetishtirildi, har birida 10% homila sigir zardobi, 4 mMl. glutamin, 0,2 mM penitsillin va 0,05 mM streptomitsin.Hujayralar inkubatorda 5% CO2 37°C da yetishtirildi.Boshqa glioma hujayra liniyasi, U118, U87 hujayralari bilan taqqoslash uchun ishlatilgan.
T. gondii yuqtirgan RH va ME49 shtammlaridan ekzosomalarni ajratib olish uchun T. gondii tachyzoitlari (RH shtammi) 3-4 kun oldin AOK qilingan 6 haftalik BALB/c sichqonlarining qorin bo'shlig'idan yig'ib olingan.Taxizoitlar PBS bilan uch marta yuvildi va 40% Perkolda (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh)43 sentrifugalash orqali tozalandi.ME49 shtammining taxizoitlarini olish uchun BALB/c sichqonlari qorin bo'shlig'iga 20 ta to'qima kistalari yuborildi va kistalardagi taxizoit transformatsiyasi infektsiyadan (PI) keyin 6-8-kun qorin bo'shlig'ini yuvish orqali yig'ildi.PBS bilan kasallangan sichqonlar.ME49 taxizoitlari 100 mkg/ml penitsillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, AQSh), 100 mkg/ml streptomitsin (Gibco/BRL) va 5% homila sigir zardobi (Lonza, Walkersville, MD) bilan to'ldirilgan hujayralarda o'stirildi. .., AQSh) 37 °C va 5% karbonat angidrid.Vero hujayralarida etishtirilgandan so'ng, ME49 taxizoitlari qoldiq va hujayralarni olib tashlash uchun 25 kalibrli igna orqali ikki marta, keyin esa 5 mikron filtrdan o'tkazildi.Yuvishdan keyin taxizoitlar PBS44 da qayta suspenziya qilindi.Toxoplasma gondii ME49 shtammining to'qimalar kistalari infektsiyalangan C57BL/6 sichqonlari miyasidan ajratilgan kistalarni qorin bo'shlig'iga yuborish orqali saqlangan (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Koreya).ME49 bilan kasallangan sichqonlarning miyalari 3 oylik PIdan so'ng yig'ib olindi va kistlarni ajratish uchun mikroskop ostida maydalangan.Yuqtirilgan sichqonlar Seul milliy universiteti tibbiyot fakultetida patogensiz maxsus sharoitlarda (SPF) saqlangan.
Jami RNK BV2 dan olingan ekzosomalar, BV2 hujayralari va to'qimalardan miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germaniya) yordamida ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq, shu jumladan elutsiya bosqichi uchun inkubatsiya vaqtiga muvofiq ajratildi.RNK konsentratsiyasi NanoDrop 2000 spektrofotometrida aniqlangan.RNK mikromassivlarining sifati Agilent 2100 bioanalizatori (Agilent Technologies, Amstelven, Niderlandiya) yordamida baholandi.
10% ekzosoma kambag'al FBS bilan DMEM 4 ° C da 16 soat davomida 100 000 g ultratsentrifugalash orqali tayyorlangan va 0,22 mkm filtrdan filtrlangan (Nalgene, Rochester, NY, AQSh).BV2 xujayralari, 5 × 105, 37 ° C va 5% CO2 da 10% ekzosoma bilan yo'qolgan FBS va 1% antibiotiklarni o'z ichiga olgan DMEMda o'stirildi.24 soatlik inkubatsiyadan so'ng, hujayralarga RH yoki ME49 (MOI = 10) shtammining taxizoitlari qo'shildi va bir soat ichida invaziv bo'lmagan parazitlar olib tashlandi va DMEM bilan to'ldiriladi.BV2 hujayralaridan ekzosomalar eng ko'p qo'llaniladigan usul bo'lgan modifikatsiyalangan differensial santrifüjlash orqali ajratildi.RNK yoki oqsil tahlili uchun 300 µl PBSda ekzosoma pelletini qayta suspenziya qiling.Izolyatsiya qilingan ekzosomalar kontsentratsiyasi BCA oqsil tahlili to'plami (Pirs, Rockford, IL, AQSh) va NanoDrop 2000 spektrofotometri yordamida aniqlandi.
BV2 hujayralari yoki BV2 dan olingan ekzozomalardan olingan cho'kmalar PRO-PREP™ protein ekstraktsiyasi eritmasida (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Koreya) lizing qilindi va oqsillar Coomassie yorqin ko'k rangga bo'yalgan 10% SDS poliakrilamid jellariga yuklandi.Bundan tashqari, oqsillar PVDF membranalariga 2 soat davomida o'tkazildi.G'arbiy dog'lar Alix antikori (Cell Signaling Technology, Beverli, MA, AQSh) yordamida ekzosomal marker sifatida tasdiqlangan.Ikkilamchi antikor sifatida HRP-konjugatsiyalangan echki sichqonchaga qarshi IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, AQSH) va LAS-1000 plus lyuminestsent tasvir analizatori (Fuji Photographic Film, Tokio, Yaponiya) ishlatilgan..Ekzozomalarning o'lchamlari va morfologiyasini o'rganish uchun transmissiya elektron mikroskopiyasi amalga oshirildi.BV2 hujayralaridan ajratilgan ekzosomalar (6,40 µg/ml) uglerod bilan qoplangan to‘rlarda tayyorlangan va 1 daqiqa davomida 2% uranil asetat bilan salbiy bo‘yalgan.Tayyorlangan namunalar ES1000W Erlangshen CCD kamerasi (Gatan, Pleasanton, CA, AQSh) bilan jihozlangan JEOL 1200-EX II (Tokio, Yaponiya) yordamida 80 kV tezlashtiruvchi kuchlanishda kuzatildi.
BV2 dan olingan ekzosomalar PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) yordamida xona haroratida 15 daqiqa davomida bo'yalgan.U87 xujayralari, 2 × 105, PKH26 yorlig'i bilan belgilangan ekzosomalar (qizil) yoki salbiy nazorat sifatida ekzosomalar yo'q, 5% CO2 inkubatorida 37 ° C da 24 soat davomida inkubatsiya qilindi.U87 hujayra yadrolari DAPI (ko'k) bilan bo'yalgan, U87 hujayralari 4 ° C da 15 daqiqa davomida 4% paraformaldegidda o'rnatildi va keyin Leica TCS SP8 STED CW konfokal mikroskop tizimida tahlil qilindi (Leica Microsystems, Mannheim, Germaniya).kuzatilishi mumkin.
cDNK siRNK dan Mir-X siRNA birinchi strand sintezi va SYBR qRT-PCR to'plami (Takara Bio Inc., Shiga, Yaponiya) yordamida sintez qilindi.Haqiqiy vaqtda miqdoriy PCR SYBR Premix bilan aralashtirilgan primerlar va shablonlardan foydalangan holda iQ5 real vaqtda PCR aniqlash tizimi (Bio-Rad, Hercules, CA, AQSh) yordamida amalga oshirildi.DNK 95 ° C da 15 soniya davomida 40 denaturatsiya davri va 60 s davomida 60 ° C da tavlanish uchun kuchaytirildi.Har bir PCR reaktsiyasidan olingan ma'lumotlar iQ™5 optik tizim dasturining (Bio-Rad) ma'lumotlarni tahlil qilish moduli yordamida tahlil qilindi.Tanlangan maqsadli genlar va b-aktin/siRNA (va U6) o'rtasidagi gen ekspresyonidagi nisbiy o'zgarishlar standart egri usuli yordamida hisoblangan.Amaldagi primer ketma-ketligi 1-jadvalda ko'rsatilgan.
3 x 104 U87 glioma hujayralari 96-quduqli plastinkalarga ekilgan va 12, 18 va 36 soatlarda nazorat sifatida BV2 (50 mkg/ml) yoki BV2 (50 mkg/ml) dan olingan toksoplazma bilan kasallangan ekzosomalar bilan aralashtirildi. .Hujayra ko'payish tezligi Hujayralarni hisoblash to'plami-8 (Dojindo, Kumamoto, Yaponiya) yordamida aniqlandi (Qo'shimcha raqamlar S1-S3) 46.
5 haftalik urg'ochi BALB/c yalang'och sichqonlari Orient Bio (Seongnam-si, Janubiy Koreya) dan sotib olindi va xona haroratida (22 ± 2 ° C) va namlikda (45 ± 15 ° C) steril qafaslarda alohida saqlanadi.%) xona haroratida (22±2°C) va namlikda (45±15%).SPF (Seul Milliy Universiteti Tibbiyot Hayvonlar Markazi) ostida 12 soatlik yorug'lik aylanishi va 12 soatlik qorong'u tsikl amalga oshirildi.Sichqonlar tasodifiy ravishda har biri 5 ta sichqondan iborat uchta guruhga bo'lindi va barcha guruhlarga teri ostiga 1 x 107 U87 glioma hujayralari va o'sish omilini kamaytiradigan BD Matrigel™ (BD Science, Mayami, FL, AQSh) o'z ichiga olgan 400 ml PBS yuborildi.O'simta in'ektsiyasidan olti kun o'tgach, o'simta joyiga BV2 hujayralaridan olingan 200 mg ekzosomalar (Toksoplazma infektsiyasi bilan / bo'lmagan holda) yuborildi.O'sma infektsiyasidan yigirma ikki kun o'tgach, har bir guruhdagi sichqonlarning o'simta hajmi haftada uch marta kaliper bilan o'lchandi va o'simta hajmi quyidagi formula bo'yicha hisoblandi: 0,5 × (kenglik) × 2 × uzunlik.
miRCURYTM LNA miRNA massividan foydalangan holda MicroRNK ifoda tahlili, 7-avlod mmu va rno massivlariga ega (EXIQON, Vedbaek, Daniya) 3100 ta odam, sichqon va kalamush miRNK ushlash zondlari orasida 1119 ta yaxshi tavsiflangan sichqonlarni qamrab oladi.Ushbu protsedura davomida 250 dan 1000 ng gacha jami RNK 5′-fosfatdan buzoq ichak ishqoriy fosfatazasi bilan ishlov berish va Hy3 yashil floresan bo'yoq bilan etiketlash orqali olib tashlandi.Keyin etiketli namunalar gibridizatsiya kamerasi to'plami (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AQSH) va gibridizatsiya slaydlari to'plami (Agilent Technologies) yordamida mikroarray slaydlarini yuklash orqali gibridlangan.Gibridizatsiya 56 ° C da 16 soat davomida amalga oshirildi, so'ngra mikroarraylar ishlab chiqaruvchining tavsiyalariga muvofiq yuvildi.Keyin qayta ishlangan mikroarray slaydlari Agilent G2565CA mikroarrayli skaner tizimi (Agilent Technologies) yordamida skanerdan o'tkazildi.Skanerlangan tasvirlar Agilent Feature Extraction dasturining 10.7.3.1 (Agilent Technologies) versiyasidan foydalangan holda import qilingan va har bir tasvirning floresans intensivligi o'zgartirilgan Exiqon protokolining tegishli GAL fayli yordamida hisoblangan.Joriy tadqiqot uchun mikroarray ma'lumotlari GEO ma'lumotlar bazasiga kirish raqami GPL32397 ostida saqlanadi.
Toksoplazma bilan kasallangan RH yoki ME49 shtammlarining mikrogliyalarida etuk ekzosomal miRNKlarning ekspressiya profillari turli tarmoq vositalari yordamida tahlil qilindi.O'simta rivojlanishi bilan bog'liq miRNKlar miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) yordamida aniqlangan va normallashtirilgan signal intensivligi (log2) 8,0 dan kattaroq filtrlangan.MiRNKlar orasida differensial ravishda ifodalangan miRNKlar T. gondii bilan kasallangan RH yoki ME49 shtammlari bilan o'zgartirilgan miRNKlarning filtr tahlili orqali 1,5 barobardan ko'proq o'zgarganligi aniqlandi.
Hujayralar Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, AQSh) yordamida opti-MEMda (Gibco, Carlsbad, CA, AQSH) olti quduqli plitalarga (3 x 105 hujayra / quduq) ekilgan.Transfektsiyalangan hujayralar 6 soat davomida ekilgan va keyin muhit yangi to'liq muhitga almashtirilgan.Hujayralar transfeksiyadan 24 soat o'tgach yig'ib olindi.
Statistik tahlil asosan Excel dasturi (Microsoft, Vashington, AQSH) yordamida Student's t-test yordamida amalga oshirildi.Hayvonlarni eksperimental tahlil qilish uchun Prism 3.0 dasturiy ta'minoti (GraphPad Software, La Jolla, CA, AQSh) yordamida ikki tomonlama ANOVA amalga oshirildi. P-qiymatlari <0,05 statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblanadi. P-qiymatlari < 0,05 statistik ahamiyatga ega deb hisoblanadi. Znacheniya P <0,05 schitalis statisticheski znachimymi. P <0,05 qiymatlari statistik ahamiyatga ega deb hisoblanadi. P y< 0.05 língīngīngīngīngīngīng P x<0,05 Znacheniya P <0,05 schitalis statisticheski znachimymi. P <0,05 qiymatlari statistik ahamiyatga ega deb hisoblanadi.
Ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha eksperimental protokollar Seul Milliy Universiteti Tibbiyot Maktabining Institutsional Tadqiq Kengashi (IRB raqami SNU-150715-2) tomonidan tasdiqlangan.
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. va boshqalar.2018 yilda global saraton kasalligi va o'lim darajasi: GLOBOCAN manbalari va usullari.Izoh.J. Ruk 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Miya shishlarining xavf omillari va ularning terapevtik aralashuvi haqida tushuncha. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Miya shishlarining xavf omillari va ularning terapevtik aralashuvi haqida tushuncha.Rashid, S., Rehman, K. va Akash, MS. Miya shishi va asosiy terapevtik aralashuvlar uchun xavf omillarini ko'rib chiqish. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Miya shishi xavf omillari va terapevtik aralashuvlarni chuqur tushunish.Rashid, S., Rehman, K. va Akash, MS. Miya shishi va asosiy terapevtik aralashuvlar uchun xavf omillarini ko'rib chiqish.Biotibbiyot fan.Farmatsevt.143, 112119 (2021 yil).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Odamning ovqat hazm qilish tizimi va ayol jinsiy a'zolarining saraton kasalliklarida bakterial-virusli o'zaro ta'siri: epidemiologik va laboratoriya dalillarining qisqacha mazmuni. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Odamning ovqat hazm qilish tizimi va ayol jinsiy a'zolarining saraton kasalliklarida bakterial-virusli o'zaro ta'siri: epidemiologik va laboratoriya dalillarining qisqacha mazmuni.Kato I., Chjan J. va Sun J. Odamning oshqozon-ichak trakti va ayol jinsiy yo'llarining saraton kasalligida bakterial-virusli o'zaro ta'siri: epidemiologik va laboratoriya ma'lumotlarining qisqacha mazmuni. Kato, I., J. & Sun, J. 口腔 的 消化 消化 消化 的 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 消化 相互 相互 相互 相互 相互 相互 相互 和 和 总结 ↑. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Insonning og'iz bo'shlig'ida ovqat hazm qilish va ayol jinsiy tizimida bakterio-virusli o'zaro ta'sir: mashhur kasallik fanlari va laboratoriya dalillarining xulosasi.Kato I., Chjan J. va Sun J. Inson oshqozon-ichak saratoni va ayol jinsiy a'zolari saratonida bakterial-virusli o'zaro ta'sirlar: epidemiologik va laboratoriya ma'lumotlarining qisqacha mazmuni.Saraton 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Infektsiyadan saratonga: DNK o'simtasi viruslari mezbon hujayraning markaziy uglerod va lipid metabolizmini qanday o'zgartiradi. Magon, KL & Parish, JL Infektsiyadan saratonga: DNK o'simtasi viruslari mezbon hujayraning markaziy uglerod va lipid metabolizmini qanday o'zgartiradi.Mahon, KL va Parish, JL Saratonga qarshi yong'in infektsiyasi: DNKga asoslangan o'simta viruslari hujayraning markaziy uglerod va lipid metabolizmini qanday o'zgartiradi. Magon, KL & Parish, JL míngínínín: DNK língíngíngíníngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngínínínė Magon, KL & Parish, JL. Infektsiyadan saratongacha: DNK o'simtasi viruslari hujayraning markaziy uglerod va lipid metabolizmini qanday o'zgartiradi.Mahon, KL va Parish, JL Saraton infektsiyasini yoqib yuboradi: DNK o'simtasi viruslari xost hujayralarida markaziy uglerod va lipid metabolizmini qanday o'zgartiradi.Ochiq biologiya.11, 210004 (2021 yil).
Correia da Kosta, JM va boshqalar.Shistosomalarning katexol estrogenlari va jigar flukes va gelmint bilan bog'liq saraton.old.ichida issiq.5, 444 (2014).