Giardia o'n ikki barmoqli ichak parazitar organizm bo'lib, giardiazni keltirib chiqaradigan ichak infektsiyasi, ayniqsa diareya klinik belgilari bo'lgan yosh bolalarda keng tarqalgan.Biz avvalroq xabar bergan edikki, hujayradan tashqari G. duodenalis hujayra ichidagi oligomerizatsiyaga o'xshash retseptorlari 3 (NLRP3) bog'lovchi nukleotidlarning faollashuvini qo'zg'atadi va hujayradan tashqari vesikula (EV) sekretsiyasi orqali xostning yallig'lanish reaktsiyalarini tartibga soladi.Shu bilan birga, ushbu jarayonda ishtirok etadigan patogen bilan bog'liq bo'lgan duodenokokk EV (GEV) ning aniq molekulyar naqshlari va giardiazdagi NLRP3 yallig'lanishining roli hali ham aniqlanmagan.
GEVdagi rekombinant eukaryotik ekspresyon plazmidlari pcDNA3.1(+)-alfa-2 va alfa-7.3 giardinlari tuzilgan, sichqonchaning asosiy peritoneal makrofaglariga transfektsiya qilingan va yallig'lanishning maqsadli molekulasi kaspaza-1ni o'lchash yo'li bilan aniqlangan.p20 ifoda darajasi ko'zdan kechirildi..G. duodenalis alfa-2 va alfa-7.3 giardines dastlab NLRP3 yallig'lanishi (NLRP3, pro-interleykin-1 beta [IL-1b], pro-kaspaz-1 va kaspaz-1 p20), IL sekretsiyasini o'lchash orqali aniqlangan.1b darajalari, apoptotik dog'li oqsil (ASC) oligomerizatsiya darajalari va NLRP3 va ASC ning immunofluoresan lokalizatsiyasi.Keyin NLRP3 inflamasomasining G. duodenalis patogenligidagi roli NLRP3 faollashuvi bloklangan (NLRP3 blokirovka qilingan sichqonlar) va tana vaznidagi patologik o'zgarishlar, o'n ikki barmoqli ichak parazit yuki va o'n ikki barmoqli ichak to'qimalari kuzatilgan sichqonlar yordamida baholandi.Bundan tashqari, biz alfa-2 va alfa-7.3 hiardinlari NLRP3 yallig'lanishi orqali in vivo jonli ravishda IL-1b sekretsiyasini qo'zg'atadimi yoki yo'qligini tekshirdik va bu molekulalarning sichqonlarda G. duodenalis patogenligidagi rolini aniqladik.
Alfa-2 va alfa-7.3 giardinlari in vitro NLRP3 yallig'lanishining faollashuvini keltirib chiqaradi.Bu p20 kaspaza-1 ning faollashishiga, NLRP3, pro-IL-1b va pro-kaspaza-1 oqsillarining ekspressiya darajasining oshishiga, IL-1b sekretsiyasining sezilarli darajada oshishiga, qonda ASA dog'larining paydo bo'lishiga olib keldi. sitoplazma va ASA oligomerizatsiyasining induksiyasi.NLRP3 yallig'lanishi Jinsiy olatni yo'qotish sichqonlarda G. duodenalisning patogenligini kuchaytiradi.NLRP3 blokirovka qilingan sichqonlardan gavaj orqali kistalar bilan davolash qilingan sichqonlarda trofozoitlarning ko'payishi va o'n ikki barmoqli ichak villi jiddiy shikastlanishi, kichraygan va shoxlangan nekrotik kriptlar bilan tavsiflangan.In vivo tajribalar shuni ko'rsatdiki, alfa-2 va alfa-7,3 giardinlari NLRP3 yallig'lanishi orqali IL-1b sekretsiyasini qo'zg'atishi mumkin va alfa-2 va alfa-7,3 giardinlari bilan immunizatsiya sichqonlarda G. duodenalisning patogenligini pasaytiradi.
Birgalikda olib borilgan ushbu tadqiqot natijalari shuni ko'rsatadiki, giardia alfa-2 va alfa-7.3 xost NLRP3 yallig'lanishining ko'payishiga olib keladi va sichqonlarda G. duodenalis infektsiyasini kamaytiradi, bu giardiazning oldini olish uchun istiqbolli maqsadlardir.
Giardia duodenum - bu ingichka ichakda yashovchi hujayradan tashqari protozoan parazit bo'lib, har yili diareya bilan 280 million lyamblioz kasalligini, ayniqsa rivojlanayotgan mamlakatlardagi yosh bolalarni keltirib chiqaradi [1].Odamlar M. oʻn ikki barmoqli ichak kistalari bilan zaharlangan ichimlik suvi yoki oziq-ovqat bilan kasallanadi, keyinchalik ular oshqozonga kirib, meʼda shirasi bilan chiqariladi.Giardia duodenum trofozoitlari o'n ikki barmoqli ichak epiteliysiga yopishib, ko'ngil aynishi, qusish, diareya, qorin og'rig'i va vazn yo'qotishiga olib keladi.Immunitet tanqisligi va kist fibrozisi bo'lgan odamlar infektsiyaga moyil.Infektsiya og'zaki va anal jinsiy aloqa orqali ham sodir bo'lishi mumkin [2].Metronidazol, tinidazol va nitazoksanid kabi dorilar o'n ikki barmoqli ichak infektsiyalari uchun afzal qilingan davolash usullaridir [3].Biroq, bu kimyoterapiya preparatlari ko'ngil aynish, kanserogenez va genotoksisite kabi nojo'ya ta'sirlarni keltirib chiqaradi [4].Shuning uchun G. duodenalis infektsiyasining oldini olish uchun yanada samarali strategiyalarni ishlab chiqish kerak.
Yallig'lanishlar - bu sitozolik oqsil komplekslarining klassi bo'lib, ular tug'ma immunitet reaktsiyasining bir qismi bo'lib, patogenlar hujumidan himoyalanishga va yallig'lanish reaktsiyalariga vositachilik qilishga yordam beradi [5].Ushbu yallig'lanishlar orasida nukleotidlarni bog'laydigan oligomerizatsiya (NOD) retseptorlari 3 (NLRP3) nukleotidlarni bog'laydigan oligomerizatsiya (NLRP3) nukleotidlarni bog'laydigan o'xshash yallig'lanishlar keng miqyosda o'rganilgan, chunki uni turli patogen/zarar/molekulyar naqshlar (PAMP) bilan aniqlash mumkin. DAMP), tug'ma immunitet tizimini taniydi, faollashtiradi.va ko'plab yallig'lanish kasalliklarida ichak gomeostazini tartibga soladi [6,7,8].U naqshni aniqlash retseptoridan (PRR) NLRP3, adapter apoptotik dog'li oqsil (ASC) va effektor prokaspaza-1 yoki prokaspaza-11 dan iborat.NLRP3 yallig'lanishi Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] va Leishmania tadqiqotlarida kuzatilganidek, patogen invaziyaga qarshi xost vazifasini bajaradi.[11], ammo NLRP3 yallig'lanishining faollashishi himoya immun javoblarini cheklaydi va kasallikning rivojlanishini kuchaytiradi, masalan, qurtlarda [12].Oldingi topilmalarimizga asoslanib, biz hujayradan tashqari G. duodenalis NLRP3 yallig'lanishining hujayra ichidagi faollashuvini qo'zg'atadi va hujayradan tashqari vesikulalarni (EVs) ajratish orqali xostning yallig'lanish reaktsiyalarini modulyatsiya qiladi, deb xabar berdik.Biroq, in vivo jonli ravishda G. duodenalis infektsiyasida NLRP3 inflamasomasining rolini aniqlash kerak.
Giardinlar dastlab G. duodenalis sitoskeletining tarkibiy qismlari sifatida tavsiflangan va trofozoit harakatchanligi va ingichka ichakdagi epiteliya hujayralarining biriktirilishida muhim rol o'ynaydi.Atrof muhitga yaxshiroq moslashish va ularning patogenligini oshirish uchun G. duodenalis trofozoitlari 8 ta flagella, 1 o'rta tana va 1 ventral diskdan iborat noyob sitoskeletal tuzilmani ishlab chiqdilar [14].Giardia duodenum trofozoitlari o'zlarining sitoskeletlari bilan ingichka ichakning yuqori qismiga, ayniqsa o'n ikki barmoqli ichakka kirib, enterotsitlarga yopishadi.Ular doimiy ravishda ko'chib o'tadi va hujayra metabolizmi yordamida epiteliya hujayralariga biriktiriladi.Shuning uchun ularning sitoskeleti va virulentligi o'rtasida yaqin bog'liqlik mavjud.Giardia o'n ikki barmoqli ichakka xos bo'lgan lyardinalar sitoskeleton tuzilishining tarkibiy qismlari [15] va to'rt sinfga bo'linadi: a-, b-, g- va d-giardinalar.A-giardinlar oilasining 21 a'zosi mavjud bo'lib, ularning barchasi fosfolipidlarni bog'lash uchun kaltsiyga bog'liq qobiliyatga ega [16].Shuningdek, ular sitoskeletonni hujayra membranasi bilan bog'laydi.G. duodenalis sabab bo'lgan diareya bilan og'rigan odamlarda a-giardinlar yuqori darajada ifodalangan va infektsiya paytida immunoreaktivdir [17].Giardia alfa-1 asosidagi geterologik vaktsinalar sichqonlarda giardiazdan himoyalangan va vaktsinani ishlab chiqish uchun potentsial nomzod antijenlerdir [18].Alpha-8 giardin, plazma membranasi va flagellada lokalizatsiya qilingan, ammo qorincha diskda emas, G. duodenalisdagi trofozoitlarning harakatchanligini va o'sish tezligini oshiradi [19].Alpha-14 giardin flagelladagi mikronaycha tuzilmalariga yopishadi va G. duodenalisning hayotiyligiga ta'sir qiladi [20].Alfa-11 giardin butun hayot davomida ko'p miqdorda mavjud va alfa-11 giardinning haddan tashqari ko'payishi G. duodenalisning o'ziga zarar etkazadi [21].Biroq, alfa-2 giardin va alfa-7,3 giardin G. duodenalis infektsiyasidan va ularning asosiy mexanizmlaridan himoya qiladimi yoki yo'qmi aniq emas.
Ushbu tadqiqotda rekombinant eukaryotik ekspresyon plazmidlari pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardine va pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardin NLRP3 xostini faollashtirish uchun sichqonchaning asosiy peritoneal makrofaglariga transfektsiya qilindi.Keyin yallig'lanish maqsadlari tekshirildi.Shuningdek, biz NLRP3 yallig'lanishining G. duodenalis patogenligidagi rolini baholadik, alfa-2 va alfa-7,3 giardinlarning NLRP3 yallig'lanishini in vivo jonli ravishda faollashishini tekshirdik va giardinalarning patogenligidagi bu ikki rolini aniqladik. G. duodenalis.Bizning umumiy maqsadimiz G. duodenalis infektsiyasining oldini olish bo'yicha istiqbolli maqsadlarni ishlab chiqish edi.
Yovvoyi turdagi (WT) C57BL / 6 5-8 haftalik urg'ochi sichqonlar Liaoning Changsheng eksperimental hayvonlar markazidan (Liaoning, Xitoy) sotib olingan.Sichqonlar suvga erkin kirish imkoniga ega bo'lib, sterillangan oziq-ovqat oldi va 12/12 soat yorug'lik / qorong'u tsiklda saqlangan.Infektsiyadan oldin, sichqonlar ampitsillin (1 mg / ml), vankomitsin (1 mg / ml) va neomitsin (1,4 mg / ml) (barchasi Shanxay, Xitoydan sotib olingan, sun'iy organizmlar) bilan to'ldirilgan ichimlik suvida ad libitum antibiotiklar oldi [22] ].].24 soatdan ortiq ovqatlanish va ichish qobiliyatini yo'qotgan va tana vaznining ≥ 20% ni yo'qotgan sichqonlar bachadon bo'yni dislokatsiyasi bilan inson tomonidan evtanizatsiya qilingan.
WB G. duodenalis trofozoitlari (Amerika tipidagi madaniyat to'plami, Manassas, AQSh) 12,5% homila sigir zardobi (FBS; Every Green, Zhejiang, Xitoy) va 0,1% sigir safro (Sigma-Aldrich, Sent-Missuri, AQSh) bilan to'ldirildi. ).AQSh) mikroaerob sharoitda.Qo'shilgan trofozoitlar muz ustida to'plangan va keyingi ko'payish uchun 1: 4 nisbatda o'tkazilgan.
Giardia o'n ikki barmoqli ichak kistalari ilgari ta'riflanganidek induktsiya qilingan [23], trofozoitlar logarifmik fazada yig'ib olingan va keyin pH 7,1 (modifikatsiyalangan TYI-S-33) bilan 1 × 106 trofozoit / ml yakuniy konsentratsiyaga qadar inkapsulatsiyani qo'zg'atuvchi vosita bilan suyultirilgan.safro konsentratsiyasi 0,05% o'rta).Trofozoitlar logarifmik o'sish bosqichiga qadar anaerob sharoitda 37 ° C da yetishtirildi.Muhitni kista qo'zg'atuvchi muhitga (pH 7,8; ​​1% safro konsentratsiyasi bilan o'zgartirilgan TYI-S-33 muhiti) va G. duodenalis madaniyatini 37 ° C da 48-96 soat davomida o'zgartiring, bu davrda kista hosil bo'lishi mikroskop ostida kuzatildi.Trofozoitlarning ko'pchiligi kistalar hosil bo'lishi uchun qo'zg'atilgandan so'ng, madaniyat aralashmasi yig'ib olindi va qolgan trofozoitlarni parchalash uchun steril deionizatsiyalangan suvda qayta suspenziya qilindi.Kistlar hisoblangan va sichqonlarda oshqozon naychasi orqali keyingi tahlillar uchun 4 ° C da saqlangan.
Giardia hujayradan tashqari pufakchalar (GEVs) ilgari tasvirlanganidek boyitilgan [13].Logarifmik o'sish fazasidagi trofozoitlar ekzosomani yo'qotgan FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Isroil) bilan tayyorlangan o'zgartirilgan TYI-S-33 muhitida 1 × 106 parazit/ml yakuniy konsentratsiyaga qadar qayta suspenziya qilindi va 12 soat davomida inkubatsiya qilindi.2000 g da 10 daqiqa, 10 000 g 45 daqiqa va 100 000 g 60 daqiqa davomida santrifüjlash orqali madaniyat supernatantidan ajratildi.Cho'kmalar fosfat tamponlangan sho'r suvda (PBS) eritildi, BCA protein tahlili to'plami (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) yordamida miqdori aniqlandi va -80 ° C da saqlangan yoki to'g'ridan-to'g'ri keyingi tahlillar uchun ishlatilgan.
Sichqonchaning birlamchi peritoneal makrofaglari ilgari tasvirlanganidek tayyorlangan [24].Qisqacha aytganda, sichqonlarga (6-8 haftalik) 2,5 ml 2,98% Difco suyuq tioglikol muhiti (BD, Franklin Lakes, NJ, AQSh) yuborilgan (intraperitoneal [ip]) va 3-4 tanglay oziqlangan.Evtanaziyadan so'ng sichqonlarning qorin bo'shlig'idan makrofaglar suspenziyasi yig'ildi va 10 daqiqa davomida 1000 g da 3 marta santrifüj qilindi.Yig'ilgan hujayralar CD11b belgisi yordamida hujayra tozaligi > 98% bo'lgunga qadar oqim sitometriyasi orqali aniqlandi, so'ngra 6 quduqli hujayra madaniyati plitalariga (4,5 x 106 hujayra / quduq) qo'shildi va 37 ° C da 10% FBS (Bioindustry) bilan inkubatsiya qilindi.va 5% CO2.
RNK 1 ml TRIzol reaktivida (Vazyme, Nankin, Xitoy) 1 × 107 trofozoitlardan olingan, MonScript dsDNase (Monad, Vuxan, Xitoy) yordamida genomik DNK umumiy G. duodenalis RNK dan olingan va komplementar DNK (cDNK) sintez qilingan. ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq MonScript RTIIII Super Mix (Monad) yordamida.
Maqsadli G. duodenalis geni uchun CDS ketma-ketligi haqidagi ma'lumot NCBI GenBank'dan olingan.Har bir maqsadli gen uchun maxsus uzluksiz klonlash primerlarini loyihalash uchun Primer 5.0 dan foydalaning.Oldinga primer (5′-3′) uch qismdan iborat: chiziqli pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) vektori bilan ustma-ust tushadigan ketma-ketlik va ATG va GNN start kodonlari (agar birinchi asos G bo'lmasa).Bu ifoda samaradorligini oshirish uchun amalga oshiriladi.Bundan tashqari, kamida 16 bp birlashtirilgan bazalar (GC tarkibi 40-60% / Tm taxminan 55 ° C).Teskari primer (5′-3′) ikki qismdan, EcoRV-linearlashtirilgan vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) bilan bir-biriga yopishgan ketma-ketlikdan va kamida 16 bp birlashtirilgan asosdan iborat.(oxirgi ikki bekatdan tashqari).asoslar) rekombinant plazmidlarga o'zlarining etiketli oqsillarini ifodalashiga imkon beradigan AA yoki GA kabi kodon).Primer ketma-ketliklari 1-jadvalda keltirilgan va Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Xitoy) tomonidan sintez qilingan.
Maqsadlar shablon sifatida tayyorlangan G. duodenalis cDNK yordamida Pfu DNK polimeraza (Tyangen, Pekin, Xitoy) yoki Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pekin, Xitoy) yordamida kuchaytirildi.Eukaryotik ifoda vektor plazmidi pcDNA3.1(+) EcoRV cheklovchi fermenti bilan linearlashtirildi va Fast AP (Thermo Fisher Scientific) yordamida fosforsizlandi.Chiziqli pcDNA3.1 (+) fragmentlari va kuchaytirilgan maqsadli gen fragmentlari DNK jeli tozalash to'plami (Tiangen) yordamida tozalandi va Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) yordamida miqdori aniqlandi.PCDNA3.1(+) fragmenti va har bir maqsadli gen fragmenti MonClone yagona yig'ma klonlash aralashmasi (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Xitoy) yordamida qayta birlashtirildi va Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Xitoy) yordamida DNK ketma-ketligi bilan tasdiqlandi..
Endotoksinsiz pcDNA3.1(+)-alfa-2 va pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 plazmidlari SanPrep Endotoksinsiz Plazmid Mini Kit (Sangon Biotech) yordamida yaratilgan.Elyusiya tamponidagi EDTA transfeksiya tahliliga xalaqit bermasligini ta'minlash uchun konsentratsiya 500 ng/ml dan yuqori bo'lgan.Sichqonchaning birlamchi peritoneal makrofaglari 12 soat davomida to'liq RPMI 1640 muhiti (Biological Industries) bilan 6 quduqli plastinkalarda o'stirildi, so'ngra hujayralar penitsillin va streptomitsinni olib tashlash uchun iliq PBSda 3 marta yuvildi, so'ngra to'liq muhit bilan to'ldirilgan muhitda.Endotoksinsiz pcDNA3.1(+)-alfa-2 va pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2.5 mkg) plazmidlar 125 mkl Opti-MEM qisqartirilgan sarum muhitida (Gibco, Thermo Fisher Scientific) suyultirildi..Keyin 5 µl Lipofektamin 2000 transfeksiya reaktivi (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 125 µl past sarumli Opti-MEM muhitida suyultirildi.Suyultirilgan endotoksinsiz plazmidni Lipofektamin 2000 bilan aralashtirish va aralashmaning xona haroratida 5 daqiqa turishiga imkon berish orqali liposoma-DNK komplekslarini tayyorlang.Komplekslarni har bir quduqdagi hujayralarga alohida o'tkazing va asta-sekin aralashtiring.4 soatdan keyin hujayra madaniyat muhiti 2 ml to'liq RPMI 1640 muhiti bilan almashtirildi va madaniyat 24 soat davomida davom ettirildi.Yangi hujayra madaniyat muhiti hujayralarga qo'shildi va tahlil dizayniga qarab turli vaqt nuqtalarida inkubatsiya qilindi.
Supernatantlar va hujayra lizatlaridan olingan oqsil namunalari avval tavsiflanganidek tayyorlangan [25].Pro-IL-1b, pro-kaspaz-1, kaspaz-1 p20, NLRP3, b-aktin va His-tag uchun membranani uzatish parametrlari 200 mA / 90 min.Interleykin 1b (IL-1b; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, AQSH), kaspaza-1 (p20) (Adipogen, Shveytsariya) va NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Shveytsariya) va 1:5000 uchun His Sci tagen (Amtifilet) Wuhan, Xitoy) va b-aktin (Proteintech, Wuhan, Xitoy).
Disuksinimid suberat (DSS) bilan o'zaro bog'lanish yuqorida tavsiflanganidek amalga oshirildi [26].Hujayralar 3 marta sovuq PBS bilan yuvildi va 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES va 125 mM NaHCO3 o'z ichiga olgan 50 µl ASC reaksiya tamponida (pH 8.0) 27 kalibrli igna bilan to'liq lizing qilindi.Aralash 5000 g haroratda 3 daqiqa davomida santrifüj qilindi va pellet 10 µl DSS (DMSO da 25 mM) va 40 µl ASC reaksiya tamponi bilan 30 daqiqa davomida 37°C da tikildi.5000 g da 10 daqiqa davomida santrifüj qilingandan so'ng, granula 40 µl ASC reaksiya buferi va 10 µl 6x protein yuklash buferi (TransGen, Pekin, Xitoy) eritmasida eritildi, so'ngra eritma xona haroratida 15 soat davomida so'ndiriladi. min., Keyin 10 daqiqa qaynatib oling.Protein namunalari so'ngra 1:500 suyultirish nisbatida birlamchi anti-ASC antikorlari (Wanleibio, Shenyang, Xitoy) yordamida Western blotiga o'tkazildi.
Oldin tavsiflangan protseduradan so'ng [13], hujayra madaniyati supernatantlari yig'ib olindi va yallig'lanishga qarshi sitokin IL-1b sekretsiyasi sichqonchaning IL-1 Beta ELISA to'plami (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) yordamida aniqlandi.IL-1b standart egri chizig'idan foydalanib, OD450nm qiymatlarini oqsil kontsentratsiyasiga aylantiring.
Qopqoqlar bilan qoplangan hujayralar iliq PBSda 3 marta yumshoq yuvilgan, to'qima hujayralarini fiksatorida (Biosharp, Pekin, Xitoy) xona haroratida (RT) 10 daqiqa davomida, 0,1% Triton X-Permeabilize 100 da (PBSda suyultiriladi; Biosharp). ) xona haroratida 20 daqiqa davomida va xona haroratida 2 soat davomida 5% sigir zardobida albuminda (PBSda) bloklanadi.Keyin hujayralar mos ravishda ASC (1:100 suyultirish) yoki NLRP3 (1:100 suyultirish) va Cy3 yorliqli echkiga qarshi quyonga qarshi IgG (H+L) (1:400; EarthOx) ga qarshi asosiy antikorlar bilan 4°C da tun davomida inkubatsiya qilindi. , San-Fransisko, CA, AQSh) yoki FITC-konjugatsiyalangan echkiga qarshi sichqonchani IgG (1:400; Earthox) 37 ° C haroratda 1 soat davomida qorong'uda kechasi.Yadrolar Hoechst 33258 (10 mkg/ml; UE, Suzhou, Xitoy) bilan 5 daqiqa davomida bo‘yalgan va floresan mikroskop ostida kuzatilgan (Olimpus korporatsiyasi, Tokio, Yaponiya).
Sichqonlar to'rtta guruhga bo'lingan (har bir guruhda n = 7): (i) PBS bilan davolash qilingan salbiy nazorat guruhi (faqat PBS; gavaj 100 µl/sichqoncha PBS, so‘ngra 3 soatdan keyin kunlik qorin bo‘shlig‘iga 100 µl/sichqoncha PBS kiritiladi)., doimiy ravishda 7 kun davomida);(ii) MCC950 inhibitori bilan davolash qilingan salbiy nazorat guruhi [27] (PBS gavaj orqali 100 µl/sichqoncha, 3 soatdan so‘ng, 10 mg/kg tana vazni [BW] MCC950 [PBSda] har kuni qorin bo‘shlig‘iga kiritildi, davomiyligi 7 kun);(iii) G. duodenalis kistasi infektsiyasi guruhi (1,5 x 106 kista / sichqonchani gavaj orqali, 3 soatdan keyin, 100 mkl / sichqoncha PBS 7 kun davomida har kuni intraperitoneal yuboriladi);(iv) G. duodenalis kistasining kombinatsiyalangan infektsiya guruhi MCC950 inhibitörlerini davolash guruhi (1,5 × 106 kistalar / sichqonchani gavaj orqali, 10 mg / kg tana vazni MCC950 har kuni 7 kun davomida 3 soat davomida intraperitoneal).Har bir sichqonchaning tana vazni har kuni kuzatildi va barcha sichqonlar 7-kuni evtanizatsiya qilindi.Yig'ilgan o'n ikki barmoqli ichak (uzunligi 3 sm) 1 ml PBSda kichik bo'laklarga bo'linib, kistalar 4 ° C da PBSda bir kechada yo'q qilindi va G. duodenalis trofozoitlari.Yangi o'n ikki barmoqli ichak (uzunligi 1 sm) gematoksilin va eozin (H&E) bo'yash uchun ajratilgan.
Sichqonlar ikki guruhga bo'lingan: (i) MOCK nazorat guruhi va (ii) MCC950 inhibitör guruhi.Har bir guruhda beshta davolash mavjud edi (n = 7/davolash guruhi): (i) PBS bilan davolash salbiy nazorat guruhi (faqat PBS; 100 µl/sichqoncha PBS, mushak ichiga (IM) in'ektsiya (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plazmid manfiy nazorat guruhi (100 mkg/sichqoncha DNK, mushak ichiga yuborish orqali (iii) G. duodenalis kistasi infektsiyasi musbat nazorat guruhi (1,5 x 106 kista/sichqoncha, gavaj orqali) (iv) a plazmid pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 mkg/sichqon DNK, mushak ichiga yuborish orqali) bilan ishlov berilgan guruh va (v) pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 mkg/sichqoncha) plazmid bilan ishlov berilgan guruh DNK, 12 soatlik o'tishdan so'ng, MCC950 inhibitori guruhidagi sichqonlar 7 kun davomida MCC950 (10 mg / kg tana og'irligi) ning kunlik qorin bo'shlig'iga in'ektsiyasini oldilar, MOCK guruhidagi sichqonlar esa teng hajmdagi PBS davolashni oldilar. Qon namunalari olindi. sichqonlarning ko'z qorachig'idan to'plangan va bir kechada 4 ° C da qoldirilgan sarum namunalari IL-1b darajalari uchun ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlili (ELISA) yordamida ajratilgan.
O'ttiz besh sichqon besh guruhga bo'lingan (n = 7 / guruh).1-guruh PBS bilan davolangan salbiy nazorat guruhi edi: sichqonlar mushak ichiga 100 mkl PBS va 3 kundan keyin gavaj orqali qabul qilindi.2-guruh G. duodenalis kistalari bilan kasallangan ijobiy nazorat guruhidir: sichqonlarga 100 mkl PBS yuborilgan va 3 kundan keyin 1,5 x 106 kista / sichqonchaga intragastral AOK qilingan.Uchinchi guruh - o'n ikki barmoqli ichak kisti infektsiyasini nazorat qilish guruhi bilan birgalikda pcDNA3.1 (+) bilan plazmid immunizatsiyasi: sichqonlar 100 mkg plazmid DNK pcDNA3.1 (+) (im) og'iz orqali, 1,5 × 106 kistalar / sichqoncha 3 bir necha uchun qabul qilindi. kunlar.4 va 5-guruhlar rekombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin plazmidi yoki pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin plazmidi G. duodenalis kisti infektsiyasi bilan birgalikda edi.Eksperimental guruh: sichqonlar 100 mkg pcDNA3 oldi.1 (+) - giardin plazmid DNK (im), keyin 3 kundan so'ng, 1,5 × 106 kistalar / sichqonchani gavaj orqali AOK qilindi.Naycha orqali G. duodenalis kistasi kiritilgandan so'ng har bir sichqonchaning tana vazni nazorat qilindi.Parazitar yukni o'lchash va HE bo'yash tahlili uchun yangi o'n ikki barmoqli ichak to'plangan.
Gistopatologik o'zgarishlar ilgari chop etilgan protsedura [30] bo'yicha tahlil qilindi.Yangi o'n ikki barmoqli ichak to'qima hujayralarini fiksator bilan mahkamlangan, kerosinga solingan, 4 mkm bo'laklarga bo'lingan, H&E bilan bo'yalgan va yorug'lik mikroskopi ostida tahlil qilingan.Etti mustaqil sichqonning ettita to'qima bo'limidagi vakillik patologik o'zgarishlari davolashdan bexabar patolog tomonidan baholandi va 200x kattalashtirishda qo'lga olindi.Villi uzunligi va kriptlarning chuqurligi ilgari tasvirlangan usullarga muvofiq o'lchandi.
Natijalar in vitro va in vivo uch nusxada olingan.Grafiklar GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, AQSh) yordamida yaratilgan.Ikki guruh o'rtasidagi farqlar t-testi bilan tahlil qilindi, ≥3 guruhlar orasidagi farqlar esa SPSS dasturiy ta'minoti (22.0 versiyasi; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, AQSh) yordamida bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) orqali tahlil qilindi.Ma'lumotlar dispersiyaning bir xilligi uchun Levene testidan so'ng Bonferronining post hoc testi (B) yordamida tahlil qilindi.Muhimlik P<0,05, P<0,01 va P<0,001 (muhim emas [ns]) (P>0,05) sifatida ifodalanadi.
Kioto genlar va genomlar ensiklopediyasida (KEGG) GEV proteomikasi bo'yicha oldingi tahlilimiz yallig'lanish signalizatsiya yo'llarini faollashtirishda ko'plab maqsadlar ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatdi [13].Biz ikkita istiqbolli maqsadni tanladik, alfa-2 va alfa-7.3 giardinlar, bu molekulalarni kuchaytiramiz va ulardan pcDNA3.1 (+) eukaryotik ekspresyon vektorini qurish uchun foydalanamiz.Tartiblashtirgandan so'ng, rekombinant pcDNA3.1 (+)-alfa-2 va alfa-7.3 giardin ekspresyon plazmidlari birlamchi sichqoncha peritoneal makrofaglariga transfektsiya qilindi va yallig'lanishning kaspaz-1 p20 imzo oqsili (faollashtirilgan kaspaza-1 ning bir qismi) aniqlandi. yallig'lanishni qo'zg'atishi mumkin bo'lgan asosiy molekulalarni tushuntirish sifatida.Natijalar shuni ko'rsatdiki, alfa-2 va alfa-7,3 giardines GEVga o'xshash p20 kaspaza-1 ifodasini keltirib chiqarishi mumkin.Kaspaza-1 faollashuviga hech qanday ta'sir ko'rsatilmagan salbiy nazorat (faqat PBS) va plazmid nazorati pcDNA3.1 (+) (1-rasm).
pcDNA3.1(+)-alfa-2 va alfa-7.3 giardinlar tomonidan p20 kaspaz-1 faollashuvini o'lchash.Rekombinant eukaryotik ekspresyon plazmidlari pcDNA3.1(+)-alfa-2 va alfa-7.3 giardinlar (har bir chiziq ustida) birlamchi sichqoncha peritoneal makrofaglariga transfektsiya qilindi va madaniyat supernatantlari 24 soatdan keyin yig'ib olindi.Western blotting imzo kaspaz-1 p20 yallig'lanish oqsilining ifoda darajasini o'lchash uchun ishlatilgan.Faqat PBS davolash guruhi (yo'l C) va pcDNA3.1 (+) monoterapiya guruhi (pcDNA3.1 qator) salbiy nazorat sifatida ishlatilgan va GEV davolash guruhi ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan.Rekombinant oqsilning ifodalanishi har bir oqsilda histidin yorlig'ini aniqlash orqali tasdiqlandi va kutilgan oqsil guruhlari alfa-2 giardin (38,2 kDa) va alfa-7,3 giardin (37,2 kDa) edi.GEV, Giardia duodenum hujayradan tashqari pufakchalar, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearlashtirilgan vektor, SUP, supernatant
Alfa-2 giardin va alfa-7.3 giardin p20 kaspaza-1 ifodasini qo'zg'atadimi yoki yo'qligini aniqlash va xost NLRP3 yallig'lanish javobini faollashtirishda rol o'ynaydi, pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin va pcDNA3.1 (+) - alfa. -7.3 giardin rekombinant plazmid DNK bilan birlamchi sichqoncha peritoneal makrofaglariga transfektsiya qilindi va asosiy yallig'lanish oqsillari NLRP3 ning ekspresyon, lokalizatsiya va oligomerizatsiya darajalari aniqlandi.Ushbu tajribada GEV ijobiy nazorat guruhi sifatida ishlatilgan va davolashsiz guruh (faqat PBS) yoki pcDNA3.1 (+) transfeksiya bilan davolash guruhi salbiy guruh edi.Natijalar shuni ko'rsatdiki, GEV guruhida bo'lgani kabi, giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 va giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 ning rekombinant plazmid DNKsi NLRP3, pro-IL-1b va yuqori regulyatsiyaga olib keldi. prokaspaza-1 va kaspaza-1 faollashuvi (2a-rasm).Bundan tashqari, ikkala giardina ham sezilarli IL-1b sekretsiyasini keltirib chiqardi (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardin: ANOVA, F (4, 10) = 1,625, P = 0,00 ).;alfa-7,3 giardin: ANOVA, F (4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (2b-rasm).Aksariyat ASC oqsillari pcDNA3.1 (+) - alfa-2 yoki pcDNA3.1 (+) - alfa-dan farqli o'laroq, ishlov berilmagan guruhda yoki pcDNA3.1 (+) plazmid bilan transfektsiyalangan davolash guruhida monomerik edi. 7.3 giardin.ASC oligomerizatsiyasi GEV musbat nazorat guruhi yoki guruhining rekombinant plazmid DNKida sodir bo'lib, oligomerik shaklni ko'rsatdi (2c-rasm).Ushbu dastlabki ma'lumotlar alfa-2 giardin va alfa-7,3 giardin NLRP3 yallig'lanishini faollashtirishi mumkinligini ko'rsatadi.ASC va NLRP3 lokalizatsiyasining keyingi immunofluoresan tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, salbiy nazorat guruhida ASC oqsili sitoplazma bo'ylab tarqalib ketgan va pcDNA3.1 (+) -alfa-2 ni giardin yoki pcDNA3 bilan stimulyatsiya qilinganda nuqta signali sifatida paydo bo'lgan.1 (+) -alfa-7,3 giardin guruhi yoki GEV musbat nazorat guruhi (2d-rasm).Salbiy nazorat va plazmid bilan ishlov berilgan pcDNA 3.1 guruhlarida NLRP3 oqsil signali aniqlanmadi, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin yoki pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 ga javoban floresan signal nuqta. aniqlandi..giardin sitoplazmada yoki HEV stimulyatsiyasida topiladi (2e-rasm).Ushbu ma'lumotlar G. duodenalis giardin alfa-2 va giardin alfa-7.3 sichqonchaning asosiy peritoneal makrofaglarida NLRP3 yallig'lanishini faollashtirishini ko'rsatadi.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin va pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin sichqon peritoneal makrofaglarida NLRP3 yallig'lanishini faollashtiradi.Rekombinant eukaryotik ekspresyon plazmidlari pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin va pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinni birlamchi murin peritoneal makrofaglari va hujayralariga o'tkazing yoki ekspressiya, oligomerizatsiya tahlili uchun supernatantni 24 soat ichida yig'ib oling. , sekretsiya.va asosiy yallig'lanish oqsillarini lokalizatsiya qilish.Faqat PBS (C) guruhi va pcDNA3.1 (+) yagona davolash guruhi salbiy nazorat sifatida, GEV davolash guruhi esa ijobiy guruh sifatida ishlatilgan.NLRP3, pro-IL-1b, pro-kaspaza-1 va p20 kaspaz-1ni o'z ichiga olgan asosiy yallig'lanish oqsillari NLRP3 G'arbiy blot orqali aniqlandi.b Supernatantlarda IL-1b ning sekretsiyasi darajasi ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) yordamida aniqlandi.Nazorat va eksperimental guruhlar o'rtasidagi farqlar SPSS dasturining 22.0 versiyasidan foydalangan holda bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) orqali tahlil qilindi.Yulduzchalar **P<0.01 va ***P<0.001 guruhlari oʻrtasidagi sezilarli farqlarni koʻrsatadi.c granulalardagi ASC oligomerizatsiya darajalari DSS o'zaro bog'liqlik tahlili bilan aniqlangan, hujayra lizatlaridagi ASC darajalari esa yuklash nazorati sifatida ishlatilgan.d immunofluoresans yordamida ISC lokalizatsiyasini vizualizatsiya qilish.e NLRP3 ning lokalizatsiyasini ko'rish uchun immunofluoresans ishlatilgan.ASC, apoptotik dog'ga o'xshash oqsil;IL, interleykin;NLRP3, nukleotidlarni bog'laydigan oligomerizatsiyaga o'xshash retseptor 3;ns, muhim emas (P > 0,05)
G. duodenalis ham, u chiqaradigan GEVs ham NLRP3 yallig'lanishini faollashtiradi va in vitro mezbonning yallig'lanish reaktsiyalarini tartibga soladi.Shunday qilib, G. duodenalisning patogenligida NLRP3 yallig'lanishining roli noaniq bo'lib qolmoqda.Ushbu masalani tekshirish uchun biz G. duodenalis kistasi bilan kasallangan sichqonlar va G. duodenalis kisti + MCC950 inhibitori bilan davolash bilan kasallangan sichqonlar o'rtasida tajriba o'tkazdik va G. duodenalis kistasi bilan kasallanganida NLRP3 yallig'lanish ifodasini solishtirdik.Tajribaning batafsil sxemasi 3a-rasmda ko'rsatilgan.Turli davolash guruhlaridagi sichqonlarning tana vaznidagi o'zgarishlar kistalar bilan kasallanganidan keyin 7 kun davomida kuzatildi va natijalar 3b-rasmda ko'rsatilgan.Sof PBS bilan davolash qilingan guruh bilan solishtirganda, natijalar shuni ko'rsatdiki, (i) G. duodenalis kistasi bilan kasallangan sichqonlarning tana vazni infektsiyadan keyin 3 kundan 7 kungacha kamaydi;(ii) MCC950 inhibitori bilan davolash sichqonlarning tana vazniga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi..Yagona infektsiya guruhi bilan solishtirganda, MCC950 bilan davolangan o'n ikki barmoqli ichak infektsiyasi guruhining BW darajasi turli darajalarga kamaydi (1-kun: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2-kun: ANOVA, F (3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001 3-kun: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 5-kun: A (3, 24)=0,6497, P=0,0645; 6-kun: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175; 7-kun: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Ushbu ma'lumotlar NLRP3 yallig'lanishi sichqonlarni o'n ikki barmoqli ichak infektsiyasining dastlabki bosqichlarida (2-4 kun) sezilarli darajada vazn yo'qotishdan himoya qilishini ko'rsatadi.Keyin o'n ikki barmoqli ichakni yuvish suyuqligida G. duodenalis trofozoitlarini aniqlashni maqsad qildik va natijalar 3c-rasmda ko'rsatilgan.G. duodenalis kist infektsiyasi guruhi bilan solishtirganda, o'n ikki barmoqli ichakdagi trofozoitlar soni NLRP3 yallig'lanishini blokirovka qilgandan so'ng sezilarli darajada oshdi (t (12) = 2,902, P = 0,0133).HE bilan bo'yalgan o'n ikki barmoqli ichak to'qimalari faqat PBS va MCC950 bilan davolash qilingan salbiy nazorat bilan solishtirganda ko'rsatdi: (i) G. duodenalis kistasi infektsiyasi o'n ikki barmoqli ichak villisining shikastlanishiga olib keldi (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0488). ) va kript atrofiyasi (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis kistalari bilan kasallangan va MCC950 inhibitörleri bilan davolash qilingan sichqonlarning o'n ikki barmoqli ichak.o'n ikki barmoqli ichak villi zararlangan va o'lik (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) atrofiyasi va kript dallanishi (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (3d-rasm) f) .Ushbu natijalar NLRP3 yallig'lanishi G. duodenalisning patogenligini kamaytirishda rol o'ynashini ko'rsatadi.
Giardia o'n ikki barmoqli ichak infektsiyasida NLRP3 yallig'lanishining roli.Sichqonlar duodenokokk kistalari bilan gavalangan (iv) va keyin MCC950 (ip) bilan yoki ularsiz davolangan.PBS yoki MCC950 bilan bitta davolash guruhlari nazorat sifatida ishlatilgan.Eksperimental guruh va davolash sxemasi.b Har xil davolash guruhlaridagi sichqonlarning tana vazni 7 kun davomida kuzatilgan.G. duodenalis infektsiyasi guruhi va G. duodenalis + MCC950 infektsiyasini davolash guruhi o'rtasidagi farq SPSS dasturiy ta'minotining 22.0 versiyasidan foydalangan holda t-test orqali tahlil qilindi.Yulduzchalar *P<0.05, **P<0.01 yoki ***P<0.001 da sezilarli farqlarni bildiradi.c Parazit yuk o'n ikki barmoqli ichakni yuvish suyuqligidagi trofozoitlar sonini hisoblash yo'li bilan aniqlandi.G. duodenalis infektsiyasi guruhi va G. duodenalis + MCC950 infektsiyasini davolash guruhi o'rtasidagi farq SPSS dasturiy ta'minotining 22.0 versiyasidan foydalangan holda t-test orqali tahlil qilindi.Yulduzchalar * P <0,05 da sezilarli farqlarni ko'rsatadi.d duodenal gistopatologiyaning gematoksilin va eozin (H&E) bo'yash natijalari.Qizil o'qlar villi, yashil o'qlar kriptlarning shikastlanishini ko'rsatadi.O'lchov paneli: 100 mikron.e, f Duodenal villus balandligi va sichqoncha kripti balandligining statistik tahlili.Yulduzchalar * P<0,05 va **P<0,01 da sezilarli farqlarni ko'rsatadi.Natijalar 7 ta mustaqil biologik tajribadan olingan.BW, tana vazni;ig, intragastral etkazib berish yo'li;ip, intraperitoneal etkazib berish yo'nalishi;ns, ahamiyatli emas (P > 0,05);PBS, fosfat tamponli sho'r suv;WT, yovvoyi tur
IL-1b ning sekretsiyasi yallig'lanish faollashuvining o'ziga xos belgisidir.G. duodenalis alfa-2 giardin va alfa-7.3 giardin NLRP3 xost yallig'lanishini in vivo jonli faollashtirish yoki yo'qligini aniqlash uchun biz davolanmagan WT sichqonlarini (sham guruhi) va NLRP3 yallig'lanishli bloklangan sichqonlarni (MCC950 inhibe qilingan davolash guruhi) ishlatdik.Tajribaning batafsil sxemasi 4a-rasmda ko'rsatilgan.Eksperimental guruhlar PBS, G. duodenalis kistasini gavaj bilan davolash, pcDNA3.1 mushak ichiga yuborish va pcDNA3.1 (+) -alfa-2 giardin yoki pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinni mushak ichiga yuborish bilan davolash qilingan sichqonlardan iborat.Rekombinant plazmid mushak ichiga kiritilgandan so'ng 7-kuni sarum yig'ildi va har bir guruhda IL-1b darajasi aniqlandi.4b-rasmda ko'rsatilganidek, MOCK guruhida: (i) PBS guruhiga nisbatan, pcDNA3.1 davolash IL-1b sekretsiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmadi (ANOVA, F (4,29) = 4,062, P = 0,9998), ammo, IL-b sekretsiyasi G. duodenalis kist guruhida (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardin va pcDNA3da sezilarli darajada oshdi.1- Alfa-7,3 giardinining mushak ichiga kiritilishi sarum IL-1b darajasini sezilarli darajada oshirdi (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin pcDNA3.1-alfa-2 giardin mushak ichiga in'ektsiya guruhida yuqori darajadagi IL-1b sekretsiyasini keltirib chiqardi (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.033) .MCC950 davolash guruhi va MOCK guruhidagi har bir guruh bilan solishtirganda: (i) PBS nazorat guruhi va pcDNA3.1 nazorat guruhidagi IL-1b sekretsiyasi darajalari MCC950 inhibitori blokirovka qilinganidan keyin ma'lum darajada kamaydi, ammo farq emas edi. muhim (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) MCC950 blokirovkasidan keyin., IL-1b sekretsiyasi G. duodenalis kistasi bilan zararlangan guruhda, pcDNA3.1-alfa-2 giardin guruhida va pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin guruhida (G. duodenalis: ANOVA, F (9) sezilarli darajada kamaydi. , 58) = 3.540 , P = 0.0120 pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alfa-7.3, F: ANO5; ) = 3,540, P = 0,0164).Ushbu natijalar alfa-2 giardin va alfa-7.3 giardin in vivo jonli NLRP3 yallig'lanishining faollashuviga vositachilik qilishini ko'rsatadi.
pcDNA3.1 (+)-giardines in vivo NLRP3 xost yallig'lanishini faollashtiradi.Sichqonlar rekombinant eukaryotik ekspresyon plazmidi pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin yoki pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin bilan immunizatsiya qilindi (IM) va keyin MCC950 (ip; MCC950 guruhi) yoki yo'q (so'qmoq guruh) bilan davolash qilindi. ).PBS yoki pcDNA3.1 (+) plazmid bilan davolash guruhi salbiy nazorat sifatida, G. duodenalis kistini davolash guruhi ijobiy nazorat sifatida ishlatilgan.Eksperimental guruh va davolash sxemasi.b Sichqonlarda IL-1b ning sarum darajalari 7-kuni Elishay tahlili bilan o'lchandi.MOCK guruhidagi guruhlar o'rtasidagi farqlar bir tomonlama ANOVA yordamida tahlil qilindi va MOCK guruhi va MCC950 guruhi o'rtasidagi farqlar SPSS dasturiy ta'minotining 22.0 versiyasining t-testi yordamida tahlil qilindi.Yulduzchalar MOCK guruhidagi davolash guruhlari o'rtasidagi sezilarli farqlarni ko'rsatadi, * P<0,05 va ***P<0,001;dollar belgilari ($) MOCK guruhidagi har bir guruh va MCC950 guruhi o'rtasidagi P<0.05 da sezilarli farqlarni ko'rsatadi.Etti mustaqil biologik tajribalar natijalari.i, mushak ichiga yuborish, ns, ahamiyatsiz (P > 0,05)
NLRP3 xost yallig'lanishining alfa-2 va alfa-7,3 giardin vositachiligidagi faollashuvining G. duodenalis infektsiyasiga ta'sirini tekshirish uchun biz WT C57BL / 6 sichqonlaridan foydalandik va alfa-2 giardin va alfa-7,3 giardinni AOK qildik.plazmid mushak ichiga, 3 kundan keyin G. duodenalis kistasining oshqozon trubkasi orqali yuborilgan, shundan so'ng sichqonlar 7 kun davomida kuzatilgan.Tajribaning batafsil sxemasi 5a-rasmda ko'rsatilgan.Har bir sichqonchaning tana vazni har kuni o'lchandi, yangi o'n ikki barmoqli ichak to'qimalarining namunalari oshqozon naychasi orqali kiritilgandan keyin 7-kuni to'plandi, trofozoitlar soni o'lchandi va gistopatologik o'zgarishlar kuzatildi.5b-rasmda ko'rsatilganidek, ovqatlanish vaqtining oshishi bilan har bir guruhdagi sichqonlarning BW darajasi asta-sekin o'sib bordi.Sichqonlarning MT si G. duodenalis kistalarini intragastral yuborishdan keyin 3-kunida pasayishni boshladi va keyin asta-sekin o'sib bordi.Alfa-2 giardin va alfa7.3 giardinni mushak ichiga yuborish natijasida kelib chiqqan NLRP3 inflamasomasining faollashishi sichqonlarda vazn yo'qotishni sezilarli darajada susaytirdi (1-kun: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F (4, 30) = 1. = 0 .9754 1-kun: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 2-kun: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 2 kun: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 3-kun: pcDNA3,1-alfa-2 giard, 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 3-kun: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 4-kun: pcDNA3.1-VA-ardin; , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, 4-kun: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, 5-kun: pcDNA3.1-alpha 2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 5-kun: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 3-kun: pc -D alfa-2 giardin, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, 6-kun: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;7-kun: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 7-kun: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, <0,0001).Parazitar yuk o'n ikki barmoqli ichakda baholandi (5c-rasm).Ishlov berilmagan ijobiy nazorat va bo'sh pcDNA3.1 vektori AOK qilingan guruh bilan solishtirganda, a-2 giardin va a-7,3 giardin (pcDNA3.1-alfa) AOK qilingan guruhlarda G. duodenalis trofozoitlari soni sezilarli darajada kamaydi. -2 giardin : ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P <0.0001).Bundan tashqari, giardine alfa-7,3 sichqonlarda giardin alfa-2 ga qaraganda ko'proq himoyalangan (ANOVA, F (3, 24) = 1,209, P = 0,0081).HE bo'yash natijalari rasmda ko'rsatilgan.5d-f.Alfa-2 giardin va alfa-7,3 giardini AOK qilingan sichqonlarda G. duodenalis va bo'sh pcDNA3 vektori bilan birgalikda G. duodenalis AOK qilingan sichqonlarga nisbatan villus shikastlanishi bilan namoyon bo'lgan o'n ikki barmoqli ichak to'qimalarining shikastlanishi kamroq bo'lgan.(pcDNA3.1-alfa-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 yoki P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2.46 = 0,0028 yoki P = 0,0055) va kamaygan kript atrofiyasi (pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 yoki P = 0.0158; pcDNA3.1-alphain: A3VA- , F (3, 24) = 1.470, P = 0.0371 yoki P = 0.0191).Ushbu natijalar alfa-2 giardin va alfa-7,3 giardine in vivo NLRP3 yallig'lanishini faollashtirish orqali G. duodenalis infektsiyasini kamaytirishini ko'rsatadi.
G. duodenalis infektsiyasida pcDNA3.1 (+)-giardinlarning roli.Sichqonlar rekombinant eukaryotik ekspresyon plazmidlari pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardine yoki pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardin bilan immunizatsiya qilindi (IM) va keyin G. duodenalis kistlari (ig) bilan sinovdan o'tkazildi.PBS guruhi va pcDNA3.1 (+) + o'n ikki barmoqli ichak kistini davolash guruhi salbiy nazorat guruhlari sifatida ishlatilgan va o'n ikki barmoqli ichak kistini davolash guruhi ijobiy nazorat guruhi sifatida ishlatilgan.Eksperimental guruh va davolash sxemasi.b Har xil davolash guruhlarining har biridagi sichqonlarning MT sinovdan keyin 7 kun davomida kuzatildi.Yulduzchalar G. duodenalis guruhidagi guruhlar va pcDNA3.1 (+) -alfa-2 giardin guruhi o'rtasidagi sezilarli farqlarni ko'rsatadi, * P <0,05, **P <0,01 va ***P <0,001;dollar belgisi ($) G. duodenalisning har bir guruhi va pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardin guruhi, $$P<0.01 va $$$P<0.001 oʻrtasida sezilarli farq borligini koʻrsatadi.c Parazitar yuk o'n ikki barmoqli ichakdan 1 ml o'n ikki barmoqli ichakni yuvishda (uzunligi 3 sm) trofozoitlar sonini hisoblash yo'li bilan aniqlanadi va o'n ikki barmoqli ichakning bir sm ga parazitlar soni sifatida ifodalanadi.G. duodenalis infektsiyasi guruhi, pcDNA3.1 (+) - alfa-2 giardin guruhi va pcDNA3.1 (+) - alfa-7.3 giardin guruhi o'rtasidagi farqlar SPSS dasturiy ta'minotining 22.0 versiyasidan foydalangan holda bir tomonlama ANOVA tomonidan tahlil qilindi.Yulduzchalar **P<0.01 va ***P<0.001 da sezilarli farqlarni bildiradi.d o'n ikki barmoqli ichakdagi gistopatologik o'zgarishlar.Qizil o'qlar villi, yashil o'qlar kriptlarning shikastlanishini ko'rsatadi.O'lchov paneli: 100 mikron.e, f Sichqoncha o'n ikki barmoqli ichak villusining balandligi (e) va kript balandligi (f) ning statistik tahlili.1d-rasmdagi guruhlar o'rtasidagi farqlar SPSS dasturiy ta'minotining 22.0 versiyasidan foydalangan holda bir tomonlama ANOVA yordamida tahlil qilindi.Yulduzchalar * P<0,05 va **P<0,01 da sezilarli farqlarni ko'rsatadi.Etti mustaqil biologik tajribalar natijalari.ns, muhim emas (P > 0,05)
Giardia o'n ikki barmoqli ichak - odamlar va boshqa sutemizuvchilarning ichak paraziti bo'lib, giardiazni keltirib chiqaradi.2004 yilda u 6 yil davomida, ayniqsa past ijtimoiy-iqtisodiy ahvolga ega bo'lgan jamoalarda keng tarqalganligi sababli JSSTning beparvo qilingan kasalliklar tashabbusiga kiritilgan [32].Tug'ma immunitet tizimi G. duodenalis infektsiyasiga qarshi immunitet reaktsiyasida muhim rol o'ynaydi.Sichqoncha makrofaglari hujayradan tashqari tuzoqlarni chiqarish orqali G. duodenalisni yutib yuborishi va o'ldirishi haqida xabar berilgan [33].Oldingi tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatdiki, invaziv bo'lmagan hujayradan tashqari parazit bo'lgan G. duodenalis sichqon makrofaglarida p38 MAPK, ERK, NF-kB p65 va NLRP3 yallig'lanish signalizatsiya yo'llarini faollashtiradi va mezbonning yallig'lanish javoblarini tartibga soladi va chiqarilgan GEV bu jarayonni kuchaytirishi mumkin.13], 24].Biroq, GEVda NLRP3 yallig'lanishi bilan boshqariladigan yallig'lanish bilan bog'liq aniq PAMPlar va giardiasisdagi NLRP3 inflamasomasining roli hali ham aniqlanmagan.Ushbu ikki savolga oydinlik kiritish uchun biz ushbu tadqiqotni o'tkazdik.
NLRP3 yallig'lanishi immun hujayralari sitoplazmasida joylashgan va siydik kislotasi kristallari, toksinlar, bakteriyalar, viruslar va parazitlar kabi turli zarralar tomonidan faollashishi mumkin.Bakterial tadqiqotlarda toksinlar yallig'lanish sensorlarini faollashtiradigan, yallig'lanish va hujayra o'limiga olib keladigan asosiy PAMPlar sifatida aniqlangan [34].Staphylococcus aureus [35] va Escherichia coli [36] dan gemolizin, enterotoksindan (NHE) [37] gemolizin BL (HBL) [37] kabi tarkibiy jihatdan xilma-xil toksinlar NLRP3 yallig'lanishining faollashishiga olib keladi.Virusli tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, SARS-COV-2 konvert (E) oqsili [38] va Zika virusi NS5 oqsili [39] kabi virulent oqsillar NLRP3 retseptorlari tomonidan tan olingan muhim PAMPlardir.Parazitlarni o'rganishda ko'plab parazitlarning Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] va Leishmania [42] kabi yallig'lanish faollashuvi bilan bog'liqligi haqida xabar berilgan.Toxoplasma gondii virulentligi bilan bog'liq bo'lgan zich granulali oqsillar GRA35, GRA42 va GRA43 Lyuis kalamush makrofaglarida piroptozni qo'zg'atish uchun zarurdir [43].Bundan tashqari, ba'zi Leishmania tadqiqotlari NLRP3 yallig'lanishida ishtirok etgan individual molekulalarga, masalan, parazit membranasi lipofosfoglikan [44] yoki sink metalloproteaza [45] kabilarga qaratilgan.Anneksinga o'xshash alfa-giardinlar oilasi orasida alfa-1 giardin sichqoncha modelida G. duodenalisdan himoya qiluvchi potentsial vaktsina nomzodi ekanligi ko'rsatildi [18].Tadqiqotimizda biz G. duodenalis virulentlik omillari alfa-2 va alfa-7,3 giardinalarni tanladik, ular giardia uchun xos bo'lgan, ammo nisbatan kamroq xabar berilgan.Ushbu ikkita maqsadli gen yallig'lanish faolligini tahlil qilish uchun pcDNA3.1 (+) eukaryotik ekspresyon tizimi vektoriga klonlangan.
Sichqoncha modelimizda yirtilgan kaspaz parchalari yallig'lanish faollashuvining belgilari bo'lib xizmat qiladi.Rag'batlantirishdan so'ng NLRP3 ASC bilan o'zaro ta'sir qiladi, prokaspazalarni jalb qiladi va pro-IL-1b va pro-IL-18 ni etuk IL-1b va IL-18 ga ajratadigan faol kaspazalarni hosil qiladi, mos ravishda -18.Yallig'lanish kaspazalari (kaspazlar-1, -4, -5 va -11) tug'ma mudofaa uchun juda muhim bo'lgan va yallig'lanish va dasturlashtirilgan hujayra o'limida ishtirok etadigan sistein proteazlarining saqlanib qolgan oilasi [46].Kaspaza-1 kanonik yallig'lanishlar [47] tomonidan faollashadi, kaspazalar-4, -5 va -11 esa atipik yallig'lanishlar [48] shakllanishi paytida parchalanadi.Ushbu tadqiqotda biz sichqonchaning peritoneal makrofaglarini model sifatida ishlatdik va G. duodenalis infektsiyasini tadqiq qilishda mezbon NLRP3 yallig'lanish faollashuvining belgisi sifatida p20 kaspaz-1 parchalangan kaspaz-1ni tekshirdik.Natijalar shuni ko'rsatdiki, ko'plab alfa-giardinlar yallig'lanishning tipik faollashuvi uchun javobgardir, bu bakteriya va viruslarda ishtirok etadigan asosiy virulent molekulalarni kashf qilish bilan mos keladi.Biroq, bizning tadqiqotimiz faqat dastlabki ekrandir va klassik bo'lmagan yallig'lanishlarni faollashtiradigan boshqa molekulalar mavjud, chunki bizning oldingi tadqiqotimiz G. duodenalis infektsiyasida ham klassik, ham klassik bo'lmagan yallig'lanishlarni aniqladi [13].Yaratilgan p20 kaspaza-1 ning NLRP3 yallig'lanishi bilan bog'liqligini aniqlash uchun biz alfa-2 va alfa-7,3 giardinlarni sichqonchaning peritoneal makrofaglariga transfektsiya qildik, bu molekula oqsilining asosiy ifoda darajasini va ASC oligomerizatsiya darajasini aniqlash uchun ikkala a-giardin faollashishini tasdiqlaydi. yallig'lanishli NLRP3.Bizning natijalarimiz Manko-Prykhoda va boshqalarning natijalaridan bir oz farq qiladi, ular faqat G. muris yoki E. coli EPEC shtammlari bilan Caco-2 hujayralarini stimulyatsiya qilish NLRP3, ASC va kaspaza-1 floresans intensivligini oshirishi mumkin. sezilarli darajada bo'lmasa-da, G. muris va E. coli ning kostimulyatsiyasi uchta oqsil darajasini qanday oshirdi [49].Bu nomuvofiqlik Giardia turlari, hujayra chiziqlari va asosiy hujayralarni tanlashdagi farqlarga bog'liq bo'lishi mumkin.Shuningdek, biz G. duodenalisga ko'proq sezgir bo'lgan 5 haftalik urg'ochi WT C57BL/6 sichqonlarida MCC950 yordamida in vivo tahlillarni o'tkazdik.MCC950 kuchli va selektiv kichik molekula NLRP3 inhibitori bo'lib, nanomolyar konsentrasiyalarda kanonik va kanonik bo'lmagan NLRP3 faollashuvini bloklaydi.MCC950 NLRP3 faollashuvini inhibe qiladi, lekin AIM2, NLRC4 va NLRP1 yallig'lanish yo'llari yoki TLR signalizatsiya yo'llarining faollashuviga ta'sir qilmaydi [27].MCC950 NLRP3 faollashuvini bloklaydi, lekin NLRP3 boshlanishini, K+ oqimini, Ca2+ oqimini yoki NLRP3 va ASC o'rtasidagi o'zaro ta'sirni inhibe qilmaydi;Buning o'rniga, ASC oligomerizatsiyasini blokirovka qilish orqali NLRP3 yallig'lanish faollashuvini inhibe qiladi [27].Shuning uchun biz MCC950 dan giardin in'ektsiyasidan keyin NLRP3 yallig'lanish rolini aniqlash uchun in vivo tadqiqotda foydalandik.Faollashtirilgan kaspaza-1 p10 pro-il-1b va pro-IL-18 yallig'lanishga qarshi sitokinlarni etuk IL-1b va IL-18 ga ajratadi [50].Ushbu tadqiqotda MCC950 bilan yoki MCC950 bo'lmagan giardin bilan davolash qilingan sichqonlarda sarum IL-1b darajalari NLRP3 yallig'lanishi faollashtirilganligining ko'rsatkichi sifatida ishlatilgan.Kutilganidek, MCC950 bilan davolash sarum IL-1b darajasini sezilarli darajada kamaytirdi.Ushbu ma'lumotlar G. duodenalis giardin alfa-2 va giardin alfa-7.3 NLRP3 sichqoncha yallig'lanishini faollashtirishga qodir ekanligini aniq ko'rsatadi.
O'tgan o'n yillikda to'plangan muhim ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, IL-17A G. murisga qarshi immunitetning asosiy regulyatori bo'lib, IL-17RA signalini keltirib chiqaradi, mikroblarga qarshi peptidlarni ishlab chiqaradi va komplement faolligini tartibga soladi [51].Biroq, giardia infektsiyasi yosh kattalarda tez-tez uchraydi va yosh sichqonlarda giardia infektsiyasi himoya ta'sirini ko'rsatish uchun IL-17A reaktsiyasini faollashtirmaydi [52], bu tadqiqotchilarni boshqa immunomodulyar giardia izlashga undadi.gelmint infektsiyasining mexanizmlari.Yaqinda o'tkazilgan tadqiqot mualliflari G. muris E. coli EPEC tomonidan NLRP3 yallig'lanishini faollashtirishi mumkinligini ma'lum qildi, bu mikroblarga qarshi peptidlar ishlab chiqarishni rag'batlantiradi va uning biriktirilish qobiliyatini va ichak traktidagi trofozoitlar sonini kamaytiradi, shu bilan yo'g'on ichakning zo'ravonligini kamaytiradi. tayoqchalar keltirib chiqaradigan kasalliklar [49 ].NLRP3 yallig'lanishi turli kasalliklarning rivojlanishida ishtirok etadi.Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Pseudomonas aeruginosa hujayra o'limini oldini olish uchun makrofaglarda autofagiyani qo'zg'atadi va bu jarayon NLRP3 yallig'lanishining faollashishiga bog'liq [53].N. caninum uchun NLRP3 yallig'lanishining reaktiv kislorod turlari vositachiligida faollashishi uning xostda replikatsiyasini cheklaydi va uni potentsial terapevtik maqsad qiladi [9].Paracoccidioides brasiliensis sichqonchaning suyak iligidan olingan dendritik hujayralardagi NLRP3 yallig'lanishini faollashtirishi aniqlandi, bu esa xostni himoya qilishda muhim rol o'ynaydigan IL-1b yallig'lanish sitokinini chiqarishga olib keladi [10].Bir nechta Leishmania turlari, jumladan L. amazonensis, L. major, L. braziliensis va L. infantum chagasi makrofaglarda NLRP3 va ASC ga bog'liq kaspaza-1 ni, shuningdek, Leishmania infektsiyasini faollashtiradi.NLRP3/ASC/kaspaz-1 genida yetishmaydigan sichqonlarda parazitlarning replikatsiyasi kuchayadi [11].Zamboni va boshqalar.Leyshmaniya infektsiyasi makrofaglarda NLRP3 yallig'lanishining faollashishiga olib kelishi haqida xabar berilgan, bu hujayra ichidagi parazit replikatsiyasini cheklaydi.Shunday qilib, Leishmania oldini olish strategiyasi sifatida NLRP3 faollashuvini inhibe qilishi mumkin.In vivo tadqiqotlarda NLRP3 yallig'lanishi leyshmaniyani yo'q qilishga yordam berdi, ammo to'qimalarga ta'sir qilmadi [54].Aksincha, gelmintozlar bo'yicha tadqiqotlarda NLRP3 yallig'lanishining faollashishi mezbonning oshqozon-ichak gelmintioziga qarshi himoya immunitetini bostirdi [12].Shigella butun dunyo bo'ylab diareyani keltirib chiqaradigan asosiy bakteriyalardan biridir.Ushbu bakteriyalar P2X7 retseptorlari vositasida K+ oqimi, reaktiv kislorod turlari, lizosomal kislotalanish va mitoxondriyal shikastlanish orqali IL-1b ishlab chiqarishni qo'zg'atishi mumkin.NLRP3 yallig'lanishi fagotsitoz va makrofaglarning shigellaga qarshi bakteritsid faolligini salbiy tartibga soladi [55].Plazmodiy tadqiqotlari shuni ko'rsatdiki, AIM2, NLRP3 yoki kaspaza-1 etishmovchiligi bo'lgan Plazmodium bilan kasallangan sichqonlar yuqori darajadagi 1-toifa interferon ishlab chiqaradi va Plazmodium infektsiyasiga nisbatan chidamliroqdir [56].Biroq, sichqonlarda NLRP3 yallig'lanishining patogen faollashuvini qo'zg'atishda alfa-2 giardin va alfa-7,3 giardinning roli aniq emas.
Ushbu tadqiqotda MCC950 tomonidan NLRP3 yallig'lanishining inhibisyonu BWni kamaytirdi va sichqonlarda ichakni yuvish suyuqligidagi trofozoitlar sonini ko'paytirdi, bu esa o'n ikki barmoqli ichak to'qimalarida yanada jiddiy patologik o'zgarishlarga olib keldi.Alpha-2 giardine va alpha-7.3 giardine xost sichqonchasi NLRP3 yallig'lanishini faollashtiradi, sichqonchaning tana vaznini oshiradi, ichakni yuvish suyuqligidagi trofozoitlar sonini kamaytiradi va o'n ikki barmoqli ichakning patologik lezyonlarini engillashtiradi.Bu natijalar G. duodenalis sichqonlarda G. duodenalis patogenligini kamaytirish, alfa-2 giardine va alfa-7,3 giardine orqali NLRP3 xost inflammasome faollashtirish mumkin, deb ko'rsatadi.
Birgalikda, bizning natijalarimiz alfa-2 va alfa-7,3 giardinelarning NLRP3 xost yallig'lanishining faollashishini va sichqonlarda G. duodenalis infektsiyasini kamaytirishini ko'rsatadi.Shuning uchun bu molekulalar giardiazning oldini olish uchun istiqbolli maqsadlardir.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: umumiy ko'rinish.Yaqinda Pat Inflammning dorilarga allergiyasi borligi ma'lum bo'ldi.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: farmakoterapiyani ko'rib chiqish.Farmatsevtning ekspert fikri.2007;8: 1885–902.
Tyan Xuafeng, Chen Bin, Ven Jianfeng.Giardiasis, dori qarshiligi va yangi maqsadlarni aniqlash.Disord dori maqsadlarini yuqtiradi.2010;10:295–302.
Vang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang V, Vu X, Qin T va boshqalar NLRP3 yallig'lanish va yallig'lanish kasalliklari.Oksid Med Hujayra Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Ichak yallig'lanishi va saraton kasalligida yallig'lanishning roli.Gastroenterologiya.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Kastejon G, Blandizzi C, Fornai M. Immunitetga chidamlilik va ichak yallig'lanishi chorrahasida kanonik va atipik NLRP3 yallig'lanish faollashuvi.immunitetdan oldingi.2017;8:36.
Li L, Vang XC, Gong PT, Chjan N, Chjan X, Li S va boshqalar.ROS vositachiligida NLRP3 yallig'lanish faollashuvi N. caninum infektsiyasiga javoban ishtirok etadi.Parazit vektori.2020;13:449.