Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi.Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScript-ni ishlatmasdan taqdim etamiz.
O'pka kist fibrozini davolash uchun gen vektorlari o'tkazuvchan havo yo'llariga yo'naltirilgan bo'lishi kerak, chunki o'pkaning periferik transduktsiyasi terapevtik ta'sir ko'rsatmaydi.Virusli transduktsiyaning samaradorligi bevosita tashuvchining yashash vaqtiga bog'liq.Shu bilan birga, gen tashuvchisi kabi etkazib berish suyuqliklari nafas olish paytida tabiiy ravishda alveolalarga tarqaladi va har qanday shakldagi terapevtik zarralar shilliq qavatli transport orqali tezda chiqariladi.Nafas olish yo'llarida gen tashuvchilarning yashash vaqtini uzaytirish muhim, ammo bunga erishish qiyin.Nafas olish yo'llari yuzasiga yo'naltirilishi mumkin bo'lgan tashuvchi-konjugatsiyalangan magnit zarralar mintaqaviy nishonni yaxshilashi mumkin.In vivo tasvirlash bilan bog'liq muammolar tufayli, qo'llaniladigan magnit maydon mavjud bo'lganda, bunday kichik magnit zarralarning havo yo'llari yuzasida xatti-harakatlari yaxshi tushunilmagan.Ushbu tadqiqotning maqsadi in vivo jonli ravishda bitta va quyma zarrachalarning dinamikasi va xatti-harakatlarini o'rganish uchun anesteziya qilingan kalamushlarning traxeyasidagi bir qator magnit zarrachalarning harakatini in vivo jonli ko'rish uchun sinxrotronli tasvirdan foydalanish edi.Keyinchalik, magnit maydon mavjudligida lentiviral magnit zarrachalarni etkazib berish kalamush traxeyasida transduktsiya samaradorligini oshiradimi yoki yo'qligini ham baholadik.Sinxrotron rentgen tasviri in vitro va in vivo statsionar va harakatlanuvchi magnit maydonlarda magnit zarrachalarning harakatini ko'rsatadi.Zarrachalarni magnitlar yordamida tirik havo yo'llari yuzasi bo'ylab osongina sudrab bo'lmaydi, lekin tashish paytida konlar magnit maydon eng kuchli bo'lgan ko'rish sohasida to'planadi.Lentiviral magnit zarrachalar magnit maydon mavjudligida yetkazilganda transduktsiya samaradorligi ham olti baravar oshdi.Birgalikda olingan bu natijalar lentiviral magnit zarralar va magnit maydonlar in vivo jonli ravishda o'tkazuvchi havo yo'llarida gen vektorini nishonga olish va transduksiya darajasini yaxshilash uchun qimmatli yondashuvlar bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Kistik fibroz (KF) CF transmembran o'tkazuvchanlik regulyatori (CFTR) deb ataladigan bitta gendagi o'zgarishlar tufayli yuzaga keladi.CFTR oqsili ion kanali bo'lib, u butun tanadagi ko'plab epiteliya hujayralarida, shu jumladan havo yo'llari, mukovistsidozning patogenezida asosiy joy.CFTRdagi nuqsonlar g'ayritabiiy suv tashishga, havo yo'llari yuzasining suvsizlanishiga va havo yo'llarining sirt suyuqlik qatlami (ASL) chuqurligining pasayishiga olib keladi.Bundan tashqari, shilliq qavatli transport (MCT) tizimining nafas olish yo'llarini nafas olish zarralari va patogenlardan tozalash qobiliyatini buzadi.Bizning maqsadimiz CFTR genining to'g'ri nusxasini etkazib berish va ASL, MCT va o'pka sog'lig'ini yaxshilash uchun lentiviral (LV) gen terapiyasini ishlab chiqish va bu parametrlarni in vivo1 o'lchay oladigan yangi texnologiyalarni ishlab chiqishni davom ettirishdir.
LV vektorlari kistik fibroz gen terapiyasi uchun etakchi nomzodlardan biri hisoblanadi, chunki ular terapevtik genni havo yo'llarining bazal hujayralariga (nafas yo'li ildiz hujayralari) doimiy ravishda birlashtirishi mumkin.Bu juda muhim, chunki ular kistik fibroz bilan bog'liq bo'lgan funktsional gen-to'g'rilangan havo yo'llari yuzasi hujayralariga differensiallashib, normal hidratsiyani va shilliq qavatning tozalanishini tiklashi mumkin, bu esa umrbod foyda keltiradi.LV vektorlari o'tkazuvchan havo yo'llariga qarshi yo'naltirilishi kerak, chunki KFda o'pkaning ishtiroki shu erda boshlanadi.Vektorni o'pkaga chuqurroq etkazib berish alveolyar transduktsiyaga olib kelishi mumkin, ammo bu mukovistsidozda terapevtik ta'sir ko'rsatmaydi.Biroq, gen tashuvchisi kabi suyuqliklar tug'ilgandan keyin nafas olayotganda tabiiy ravishda alveolalarga o'tadi3,4 va terapevtik zarralar MCTlar tomonidan og'iz bo'shlig'iga tezda chiqariladi.LV transduktsiyasining samaradorligi to'g'ridan-to'g'ri vektorning hujayraning qabul qilinishini ta'minlash uchun maqsadli hujayralarga yaqin qoladigan vaqtga bevosita bog'liq - "yashash vaqti" 5, bu odatiy mintaqaviy havo oqimi, shuningdek, shilimshiq va MCT zarralarini muvofiqlashtirilgan qabul qilish bilan osonlik bilan qisqartiriladi.Kistik fibroz uchun havo yo'llarida LV yashash vaqtini uzaytirish qobiliyati bu sohada transduksiyaning yuqori darajasiga erishish uchun muhim, ammo hozirgacha qiyin bo'lgan.
Ushbu to'siqni engib o'tish uchun biz LV magnit zarralari (MP) bir-birini to'ldiruvchi ikkita usulda yordam berishi mumkinligini taklif qilamiz.Birinchidan, nishonni yaxshilash va gen tashuvchisi zarralarini havo yo'lining to'g'ri hududida bo'lishiga yordam berish uchun ular magnit yordamida havo yo'li yuzasiga yo'naltirilishi mumkin;va ASL) hujayra qatlamiga o'tadi 6. MPlar antikorlar, kimyoterapiya preparatlari yoki boshqa kichik molekulalar bilan bog'langanda, ular hujayra membranalariga yopishgan yoki tegishli hujayra yuzasi retseptorlari bilan bog'langan va o'simta joylarida to'planganda maqsadli dori vositalari sifatida keng qo'llaniladi. statik elektrning mavjudligi.Saraton terapiyasi uchun magnit maydonlar 7. Boshqa "gipertermik" usullar tebranish magnit maydonlari ta'sirida MPlarni isitish orqali o'simta hujayralarini o'ldirishga qaratilgan.DNKni hujayralarga o'tkazishni kuchaytirish uchun magnit maydon transfektsiya agenti sifatida ishlatiladigan magnit transfeksiya printsipi odatda in vitroda virusli bo'lmagan va virusli gen vektorlari diapazoni yordamida transduktsiya qilish qiyin bo'lgan hujayra chiziqlari uchun ishlatiladi. ..Statik magnit maydon mavjudligida LV MP ni in vitroda inson bronxial epiteliysining hujayra chizig'iga etkazib berish bilan LV magnitotransfeksiyasining samaradorligi aniqlandi, bu transduktsiya samaradorligini faqat LV vektoriga nisbatan 186 marta oshirdi.LV MT, shuningdek, mukovistsidozning in vitro modelida qo'llanilgan, bu erda magnit transfeksiya havo-suyuqlik interfeysi madaniyatlarida mukovistsidozli balg'am borligida LV transduktsiyasini 20 marta oshirgan10.Biroq, in vivo organ magnitotransfeksiyasi nisbatan kam e'tiborga sazovor bo'ldi va faqat bir nechta hayvonlar tadqiqotlarida baholandi11,12,13,14,15, ayniqsa o'pkada16,17.Biroq, mukovistsidozda o'pka terapiyasida magnit transfeksiyaning imkoniyatlari aniq.Tan va boshqalar.(2020) ta'kidlaganidek, "magnit nanozarrachalarni o'pkaga samarali etkazib berish bo'yicha tekshirish tadqiqoti mukovistsidozli bemorlarda klinik natijalarni yaxshilash uchun kelajakdagi CFTR inhalatsiya strategiyalariga yo'l ochadi"6.
Qo'llaniladigan magnit maydon mavjudligida nafas olish yo'llari yuzasida kichik magnit zarrachalarning xatti-harakatlarini tasavvur qilish va o'rganish qiyin, shuning uchun ular yaxshi tushunilmagan.Boshqa tadqiqotlarda biz invaziv bo'lmagan ko'rish va ASL18 chuqurligi va MCT19 xatti-harakatlaridagi daqiqali in vivo o'zgarishlarning miqdorini aniqlash uchun Sinxrotron tarqalishiga asoslangan fazali kontrastli rentgen tasviri (PB-PCXI) usulini ishlab chiqdik20, gaz kanali sirtining hidratsiyasini bevosita o'lchash uchun. va davolash samaradorligining erta ko'rsatkichi sifatida ishlatiladi.Bundan tashqari, bizning MCT baholash usuli alumina yoki yuqori sinishi indeksli oynadan tashkil topgan 10-35 mkm diametrli zarrachalarni PB-PCXI21 bilan ko'rinadigan MCT belgilari sifatida ishlatadi.Ikkala usul ham bir qator zarracha turlarini, jumladan, MPlarni tasvirlash uchun javob beradi.
Yuqori fazoviy va vaqtinchalik piksellar sonini hisobga olgan holda, bizning PB-PCXI asosidagi ASL va MCT tahlillarimiz MP genini etkazib berish usullarini tushunish va optimallashtirishga yordam berish uchun in vivo jonli ravishda bitta va ommaviy zarrachalarning dinamikasi va xatti-harakatlarini o'rganish uchun juda mos keladi.Bu erda biz qo'llayotgan yondashuv SPring-8 BL20B2 nur chizig'idan foydalangan holda olib borilgan tadqiqotlarimizga asoslangan bo'lib, unda biz sichqonlarning burun va o'pka nafas yo'llariga so'qmoq vektor dozasini yuborilgandan so'ng suyuqlik harakatini ko'rib chiqdik, bunda biz kuzatilgan heterojen gen ekspresyon naqshlarini tushuntirishga yordam beramiz. bizning genimizda.tashuvchisi dozasi bilan hayvonlarni o'rganish 3,4 .
Ushbu tadqiqotning maqsadi PB-PCXI sinxrotronidan jonli kalamushlar traxeyasida bir qator deputatlarning in vivo harakatlarini ko'rish uchun foydalanish edi.Ushbu PB-PCXI ko'rish tadqiqotlari MP seriyasini, magnit maydon kuchini va joylashuvini sinab ko'rish uchun ularning MP harakatiga ta'sirini aniqlash uchun mo'ljallangan.Biz tashqi magnit maydon yetkazib berilgan MF ning qolishiga yoki maqsadli hududga o'tishiga yordam beradi deb taxmin qildik.Ushbu tadqiqotlar, shuningdek, cho'kma so'ng traxeyada qolgan zarrachalar miqdorini maksimal darajada oshiradigan magnit konfiguratsiyalarni aniqlashga imkon berdi.Tadqiqotlarning ikkinchi qatorida biz ushbu optimal konfiguratsiyadan LV-MP ning kalamush havo yo'llariga in vivo yetkazilishi natijasida hosil bo'lgan transduksiya naqshini namoyish qilish uchun foydalanishni maqsad qilgan edik, chunki havo yo'llarini nishonga olish kontekstida LV-MPlarni etkazib berish natija beradi. LV transduktsiya samaradorligini oshirishda..
Hayvonlarning barcha tadqiqotlari Adelaida universiteti (M-2019-060 va M-2020-022) va SPring-8 Sinxrotron hayvonlar etikasi qoʻmitasi tomonidan tasdiqlangan protokollarga muvofiq oʻtkazildi.Tajribalar ARRIVE tavsiyalariga muvofiq amalga oshirildi.
Barcha rentgen tasvirlari Yaponiyadagi SPring-8 sinxrotronida BL20XU nur chizig'ida, avval tasvirlanganga o'xshash sozlash yordamida olingan21,22.Qisqacha aytganda, eksperimental quti sinxrotron saqlash halqasidan 245 m masofada joylashgan edi.Namunadan detektorga masofa 0,6 m zarrachalarni tasvirlash tadqiqotlari uchun va 0,3 m in vivo tasvirlash tadqiqotlari uchun faza kontrasti effektlarini yaratish uchun ishlatiladi.25 keV energiyaga ega bo'lgan monoxromatik nur ishlatilgan.Tasvirlar sCMOS detektoriga ulangan yuqori aniqlikdagi rentgen-transduser (SPring-8 BM3) yordamida olingan.Transduser 10 mkm qalinlikdagi sintilator (Gd3Al2Ga3O12) yordamida rentgen nurlarini ko'rinadigan yorug'likka aylantiradi, so'ngra ×10 (NA 0,3) mikroskop ob'ektivi yordamida sCMOS sensoriga yo'naltiriladi.sCMOS detektori massiv o'lchami 2048 × 2048 piksel va xom piksel o'lchami 6,5 × 6,5 mikron bo'lgan Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Yaponiya) edi.Bu sozlama 0,51 µm samarali izotrop piksel o‘lchamini va taxminan 1,1 mm × 1,1 mm ko‘rish maydonini beradi.100 ms ta'sir qilish muddati nafas olish natijasida kelib chiqadigan harakat artefaktlarini minimallashtirish va havo yo'llari ichidagi va tashqarisidagi magnit zarrachalarning signal-shovqin nisbatini maksimal darajada oshirish uchun tanlangan.In vivo tadkikotlar uchun rentgen yo'liga tezkor rentgen pardasi o'rnatildi, bu ta'sirlar orasidagi rentgen nurlarini to'sib qo'yish orqali radiatsiya dozasini cheklash.
LV muhiti SPring-8 PB-PCXI tasvirlash ishlarida foydalanilmadi, chunki BL20XU tasvirlash kamerasi Biosafety Level 2 sertifikatiga ega emas.Buning o'rniga biz ikkita tijorat sotuvchisidan bir qator o'lchamlarni, materiallarni, temir konsentratsiyasini va qo'llashni qamrab oluvchi bir qator yaxshi tavsiflangan deputatlarni tanladik - avval magnit maydonlar shisha kapillyarlardagi MP harakatiga qanday ta'sir qilishini tushunish uchun, keyin esa tirik havo yo'llari.sirt.MP ning o'lchami 0,25 dan 18 mkm gacha o'zgarib turadi va turli materiallardan tayyorlanadi (1-jadvalga qarang), lekin har bir namunaning tarkibi, shu jumladan MPdagi magnit zarrachalarning o'lchami noma'lum.19, 20, 21, 23, 24 MCT bo'yicha keng qamrovli tadqiqotlarimizga asoslanib, biz MP harakatining yaxshilangan ko'rinishini ko'rish uchun, masalan, ketma-ket ramkalarni ayirish orqali traxeya havo yo'li yuzasida 5 mkm gacha bo'lgan MPlarni ko'rishni kutamiz.0,25 mkm bo'lgan bitta MP tasvirlash moslamasining o'lchamlaridan kichikroq, ammo PB-PCXI ularning hajmli kontrastini va yotqizilganidan keyin yotqizilgan sirt suyuqligining harakatini aniqlashi kutilmoqda.
Jadvaldagi har bir MP uchun namunalar.1 ichki diametri 0,63 mm bo'lgan 20 mkl shisha kapillyarlarda (Drummond Microcaps, PA, AQSh) tayyorlangan.Korpuskulyar zarralar suvda, CombiMag zarralari esa ishlab chiqaruvchining maxsus suyuqligida mavjud.Har bir trubka yarmi suyuqlik bilan to'ldirilgan (taxminan 11 µl) va namuna ushlagichiga joylashtiriladi (1-rasmga qarang).Shisha kapillyarlar navbati bilan tasvirlash kamerasidagi sahnaga gorizontal ravishda joylashtirildi va suyuqlikning chetlariga joylashtirildi.Noyob tuproq, neodim, temir va bordan (NdFeB) (N35, kat. № LM1652, Jaycar Electronics, Avstraliya) 19 mm diametrli (uzunligi 28 mm) nikel qobig'i magniti 1,17 T remenensga ega. erishish uchun alohida uzatish jadvali Renderlash vaqtida o'z o'rningizni masofadan o'zgartiring.Rentgen tasviri magnit namunadan taxminan 30 mm balandlikda joylashganida boshlanadi va tasvirlar soniyasiga 4 kvadrat tezlikda olinadi.Tasvirlash vaqtida magnit shisha kapillyar trubkaga yaqinlashtirildi (taxminan 1 mm masofada) va keyin maydon kuchi va pozitsiyasining ta'sirini baholash uchun naycha bo'ylab harakatlantirildi.
Xy namunasini tarjima qilish bosqichida shisha kapillyarlarda MP namunalarini o'z ichiga olgan in vitro tasvirni o'rnatish.Rentgen nurlarining yo'li qizil nuqta chiziq bilan belgilanadi.
Deputatlarning in vitro ko'rinishi o'rnatilgandan so'ng, ularning bir qismi yovvoyi turdagi urg'ochi Wistar albinos kalamushlarida (~12 haftalik, ~200 g) in vivo sinovdan o'tkazildi.Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Yaponiya), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Yaponiya) va butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Kalamushlar intraperitoneal in'ektsiya yo'li bilan Pharma (Yaponiya) aralashmasi bilan behushlik qilindi.Anesteziyadan so'ng ular traxeya atrofidagi mo'ynani olib tashlash, endotrakeal naychani (ET; 16 Ga intravenöz kanül, Terumo BCT) kiritish va termal sumkani o'z ichiga olgan maxsus tayyorlangan ko'rish plastinkasida yotgan holatda immobilizatsiya qilish orqali tasvirga tayyorlandi. tana haroratini ushlab turish uchun.22. Keyin tasvirlash plitasi 2a-rasmda ko'rsatilganidek, rentgen tasvirida traxeyani gorizontal ravishda tekislash uchun tasvirlash qutisidagi namuna bosqichiga engil burchak ostida biriktirildi.
(a) SPring-8 tasvirlash moslamasida in vivo tasvirni o'rnatish, rentgen nurlari yo'li qizil nuqta chiziq bilan belgilangan.(b,c) Traxeya magnitining lokalizatsiyasi ikkita ortogonal o'rnatilgan IP kameralar yordamida masofadan amalga oshirildi.Ekrandagi tasvirning chap tomonida siz boshni ushlab turgan simli halqani va ET trubkasi ichiga o'rnatilgan etkazib berish kanülini ko'rishingiz mumkin.
100 µl shisha shprits yordamida masofadan boshqariladigan shprits nasos tizimi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 30 Ga igna yordamida PE10 trubasiga (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) ulangan.Endotraxeal trubani kiritishda uchi traxeyada to'g'ri holatda ekanligiga ishonch hosil qilish uchun trubkani belgilang.Mikropompa yordamida shprits pistoni olib tashlandi va trubaning uchi etkazib beriladigan MP namunasiga botirildi.Keyin yuklangan etkazib berish trubkasi endotrakeal trubaga kiritilib, uchini biz kutgan qo'llaniladigan magnit maydonning eng kuchli qismiga joylashtirdi.Tasvirni olish Arduino-ga asoslangan vaqt qutisiga ulangan nafas detektori yordamida boshqarildi va barcha signallar (masalan, harorat, nafas olish, tortishish ochish/yopish va tasvirni olish) Powerlab va LabChart (AD Instruments, Sidney, Avstraliya) yordamida yozib olingan. 22 Tasvirga olishda korpus mavjud bo'lmaganda, ikkita IP kamera (Panasonic BB-SC382) bir-biriga taxminan 90° burchak ostida joylashtirildi va tasvirlash paytida magnitning traxeyaga nisbatan o'rnini nazorat qilish uchun foydalanildi (2b-rasm, c).Harakat artefaktlarini minimallashtirish uchun terminal nafas olish oqimi platosida har bir nafas uchun bitta tasvir olingan.
Magnit ikkinchi bosqichga biriktirilgan bo'lib, u tasvirlash tanasining tashqi tomonida uzoqdan joylashgan bo'lishi mumkin.Magnitning turli pozitsiyalari va konfiguratsiyasi sinovdan o'tkazildi, shu jumladan: traxeyaning yuqorisida taxminan 30 ° burchak ostida joylashtirilgan (konfiguratsiyalar 2a va 3a-rasmlarda ko'rsatilgan);bir magnit hayvonning ustida, ikkinchisi pastda, qutblarni jalb qilish uchun o'rnatilgan (3b-rasm)., hayvonning tepasida va pastda bitta magnit, itarilish uchun o'rnatilgan qutblar (3c-rasm) va bitta magnit yuqorida va traxeyaga perpendikulyar (3d-rasm).Hayvon va magnitni o'rnatgandan va sinovdan o'tkazilayotgan MPni shprits pompasiga yuklagandan so'ng, tasvirlar olingandan so'ng 4 µl/sek tezlikda 50 µl dozani yuboring.Keyin magnit traxeya bo'ylab yoki bo'ylab oldinga va orqaga siljiydi va tasvirlarni olishda davom etadi.
In vivo tasvir uchun magnit konfiguratsiyasi (a) traxeya ustida taxminan 30° burchak ostida bitta magnit, (b) tortishish uchun sozlangan ikkita magnit, (c) qaytarilish uchun tuzilgan ikkita magnit, (d) yuqorida va perpendikulyar bitta magnit traxeya.Kuzatuvchi traxeya orqali og'izdan o'pkaga qaradi va rentgen nurlari kalamushning chap tomonidan o'tib, o'ng tomondan chiqdi.Magnit nafas yo'lining uzunligi bo'ylab yoki rentgen nurlari yo'nalishi bo'yicha traxeyadan chapga va o'ngga siljiydi.
Shuningdek, biz nafas olish va yurak urish tezligini aralashtirish bo'lmaganda havo yo'llarida zarrachalarning ko'rinishi va xatti-harakatlarini aniqlashga harakat qildik.Shuning uchun, tasvirlash davrining oxirida, pentobarbitalning haddan tashqari dozasi tufayli hayvonlar inson tomonidan evtanizatsiya qilindi (Somnopentil, Pitman-Mur, Washington Crossing, AQSh; ~ 65 mg / kg ip).Ba'zi hayvonlar tasvir platformasida qoldirildi va nafas olish va yurak urishi to'xtatilgandan so'ng, nafas olish yo'llari yuzasida MP ko'rinmasa, qo'shimcha MP dozasini qo'shib, tasvirlash jarayoni takrorlandi.
Olingan tasvirlar tekis va qorong'i maydon uchun tuzatildi va keyin MATLAB (R2020a, The Mathworks) da yozilgan maxsus skript yordamida filmga yig'ildi (sekundiga 20 kadr; nafas olish tezligiga qarab 15–25 × normal tezlik).
LV gen vektorini etkazib berish bo'yicha barcha tadqiqotlar Adelaida universiteti laboratoriya hayvonlar tadqiqot markazida o'tkazildi va SPring-8 eksperimenti natijalaridan magnit maydon mavjudligida LV-MP etkazib berish in vivo jonli ravishda gen transferini kuchaytirishi mumkinligini baholash uchun foydalanishga qaratilgan. .MF va magnit maydonning ta'sirini baholash uchun hayvonlarning ikkita guruhi davolandi: bir guruhga LV MF magnitlangan joylashuvi bilan, ikkinchi guruhga esa magnitsiz LV MF bilan nazorat guruhi AOK qilindi.
LV gen vektorlari ilgari tasvirlangan usullar 25, 26 yordamida yaratilgan.LacZ vektori MPSV konstitutsiyaviy promouteri (LV-LacZ) tomonidan boshqariladigan yadroviy lokalizatsiyalangan beta-galaktosidaza genini ifodalaydi, bu transduktsiyalangan hujayralarda o'pka to'qimalarining old va qismlarida ko'rinadigan ko'k rangli reaktsiya mahsulotini hosil qiladi.Titrlash TU/ml da titrni hisoblash uchun gemositometr yordamida LacZ-musbat hujayralar sonini qo'lda hisoblash yo'li bilan hujayra madaniyatlarida amalga oshirildi.Tashuvchilar -80°C da kriokonservalanadi, ishlatishdan oldin eritiladi va CombiMag bilan 1:1 nisbatda aralashtirib, yetkazib berishdan oldin kamida 30 daqiqa davomida muzda inkubatsiya qilinadi.
Oddiy Sprague Dawley kalamushlari (n = 3/guruh, ~2-3 behushlik qilingan ip 0,4mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Avstraliya) va 60mg/kg ketamin (Ilium, Avstraliya) 1 oyligida) ip ) 16 Ga vena ichiga kanül bilan in'ektsiya va jarrohlik bo'lmagan og'iz kanalizatsiyasi.Traxeya havo yo'llarining to'qimalari LV transduktsiyasini olishini ta'minlash uchun u yuqorida tavsiflangan mexanik buzilish protokoli yordamida shartlangan bo'lib, unda traxeya havo yo'li yuzasi simli savat bilan eksenel ravishda ishqalanadi (N-Circle, uchi bo'lmagan nitinolli tosh ekstraktor NTSE-022115 ) -UDH , Kuk Tibbiyot, AQSh) 30 p28.Keyin, bioxavfsizlik kabinetidagi buzilishdan taxminan 10 minut o'tgach, LV-MP ning trakeal administratsiyasi amalga oshirildi.
Ushbu tajribada ishlatiladigan magnit maydon in vivo rentgen tadqiqotiga o'xshash tarzda tuzilgan, xuddi shu magnitlar traxeyada distillash stent qisqichlari bilan ushlab turilgan (4-rasm).50 µl hajmdagi (2 x 25 µl alikvot) LV-MP traxeyaga (n = 3 ta hayvon) yuqorida aytib o‘tilganidek, gel uchli pipetka yordamida yuborildi.Nazorat guruhi (n = 3 hayvon) magnitdan foydalanmasdan bir xil LV-MP ni oldi.Infuzion tugagandan so'ng, kanül endotrakeal naychadan chiqariladi va hayvon ekstubatsiya qilinadi.Magnit olib tashlanishidan oldin 10 daqiqa davomida joyida qoladi.Kalamushlarga meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Avstraliya) teri ostiga yuborildi, so‘ngra qorin bo‘shlig‘iga 1 mg/kg atipamazol gidroxlorid (Antisedan, Zoetis, Avstraliya) yuborish orqali behushlik bekor qilindi.Kalamushlar behushlikdan to'liq tiklanishigacha issiq tutildi va kuzatildi.
Biologik xavfsizlik kabinetidagi LV-MP yetkazib berish moslamasi.Siz ET trubasining och kulrang Luer-lock yengining og'izdan chiqib turganini va rasmda ko'rsatilgan gel pipetka uchi ET trubkasi orqali traxeyaga kerakli chuqurlikka kiritilganini ko'rishingiz mumkin.
LV-MP administratsiyasidan bir hafta o'tgach, hayvonlar 100% CO2 inhalatsiyasi orqali insoniy ravishda qurbon qilindi va LacZ ifodasi bizning standart X-gal davolashimiz yordamida baholandi.Endotraxeal naychani joylashtirish natijasida yuzaga keladigan har qanday mexanik shikastlanish yoki suyuqlikni ushlab turish tahlilga kiritilmasligini ta'minlash uchun uchta eng kaudal xaftaga halqalari olib tashlandi.Har bir traxeya tahlil qilish uchun ikkita yarmini olish uchun uzunasiga kesilgan va luminal sirtni ko'rish uchun Minutien ignasi (Fine Science Tools) yordamida silikon kauchuk (Sylgard, Dow Inc) bo'lgan stakanga joylashtirilgan.Transduktsiya qilingan hujayralarning tarqalishi va xarakteri DigiLite kamerasi va TCapture dasturi (Tucsen Photonics, Xitoy) bilan Nikon mikroskopi (SMZ1500) yordamida frontal suratga olish orqali tasdiqlangan.Tasvirlar 20x kattalashtirishda (shu jumladan traxeyaning to'liq kengligi uchun maksimal sozlash) olingan bo'lib, traxeyaning butun uzunligi bosqichma-bosqich ko'rsatilib, tasvirlarni "tikish" imkonini berish uchun har bir tasvir o'rtasida etarli darajada o'xshashlikni ta'minlaydi.Keyin har bir traxeyadagi tasvirlar tekis harakat algoritmidan foydalangan holda Composite Image Editor 2.0.3 (Microsoft Research) versiyasidan foydalangan holda bitta kompozit tasvirga birlashtirildi. Har bir hayvondan olingan traxeyaning kompozit tasvirlaridagi LacZ ifoda maydoni 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 va Qiymat < 0,7 sozlamalaridan foydalangan holda, avval tavsiflanganidek28 avtomatlashtirilgan MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) yordamida hisoblangan. Har bir hayvondan olingan traxeyaning kompozit tasvirlaridagi LacZ ifoda maydoni 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 va Qiymat < 0,7 sozlamalaridan foydalangan holda, avval tavsiflanganidek28 avtomatlashtirilgan MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) yordamida hisoblangan. Ploshchad ekspressii LacZ v sostavnyx izobrajeniyah trahei ot kajdogo jivotnoho byla kolichestvenno opredelna uchun foydalanish avtomatizatsiyalangan stsenariy MATLAB (R2020a, MathWorks), qanday opisano ranee28, nastroycheskye nastroycheskym <150, nastrotenno50> ,7. Har bir hayvondan olingan kompozit traxeya tasvirlaridagi LacZ ifodasi maydoni 0,35 parametrlari yordamida oldindan tavsiflanganidek, avtomatlashtirilgan MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) yordamida hisoblangan.0,15 va qiymati<0,7.如 前所 前所, 自动 自动 自动 自动 自动 自动 自动 自动 对 来自 来自 来自 来自 来自 - 对 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 ↑, ④ 0.38 <↑, ↑, 0,15 ↑① ② ③ MATLAB 脚本 (R2020A, Matematika) ↓ ↑, 使用 使用 每 每 每 每 每 每 每 每 每 每 每 每 每 每 ↑, ↑ 使用 使用 ↑.35 <↑, 0.75 ↑ …………………………………………………………………………………………… HIP Oblasti ekspressii LacZ na sostavnyx izobrajeniyah trahei kajdogo jivotnogo kolichestvenno opredelyali va avtomatik avtomatlashtirilgan stsenariy MATLAB (R2020a, MathWorks), qanday opisano ranee, spolzovaniem nastroek570, nastroek 0, nastroek 0, <<570, <80, <br> . Har bir hayvon traxeyasining kompozit tasvirlaridagi LacZ ifodasi sohalari oldindan tavsiflanganidek, avtomatlashtirilgan MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) yordamida 0.35 < rang < 0.58, toʻyinganlik > 0.15 va qiymati < 0.7 .GIMP v2.10.24 da to‘qima konturlarini kuzatish orqali to‘qima maydonini aniqlash va traxeya to‘qimasidan tashqarida noto‘g‘ri aniqlashlarni oldini olish uchun har bir kompozitsion tasvir uchun qo‘lda niqob yaratildi.Har bir hayvondan olingan barcha kompozit tasvirlarning bo'yalgan joylari yig'ilib, ushbu hayvon uchun umumiy bo'yalgan maydon hosil bo'ldi.Keyin normallashtirilgan maydonni olish uchun bo'yalgan maydon niqobning umumiy maydoniga bo'lingan.
Har bir traxeya parafinga solingan va qalinligi 5 mkm bo'lgan qismlarga bo'lingan.Bo'limlar 5 daqiqa davomida neytral tez qizil rang bilan bo'yalgan va tasvirlar Nikon Eclipse E400 mikroskopi, DS-Fi3 kamerasi va NIS elementlarini suratga olish dasturi (5.20.00 versiyasi) yordamida olingan.
Barcha statistik tahlillar GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) da amalga oshirildi.Statistik ahamiyat p ≤ 0,05 da o'rnatildi.Oddiylik Shapiro-Wilk testi yordamida sinovdan o'tkazildi va LacZ bo'yashidagi farqlar juftlashtirilmagan t-testi yordamida baholandi.
1-jadvalda tasvirlangan oltita MP PCXI tomonidan tekshirildi va ko'rinish 2-jadvalda tasvirlangan. Ikki polistirol MP (MP1 va MP2; mos ravishda 18 mkm va 0,25 mkm) PCXI tomonidan ko'rinmas edi, ammo qolgan namunalarni aniqlash mumkin edi. (misollar 5-rasmda ko'rsatilgan).MP3 va MP4 zaif ko'rinadi (10-15% Fe3O4; mos ravishda 0,25 mkm va 0,9 mkm).MP5 (98% Fe3O4; 0,25 mkm) sinovdan o'tgan eng kichik zarralarni o'z ichiga olgan bo'lsa-da, u eng aniq bo'ldi.CombiMag MP6 mahsulotini farqlash qiyin.Barcha holatlarda magnitni kapillyarga parallel ravishda oldinga va orqaga siljitish orqali MFni aniqlash qobiliyatimiz sezilarli darajada yaxshilandi.Magnitlar kapillyardan uzoqlashganda, zarrachalar uzun zanjirlarda tortib olindi, lekin magnitlar yaqinlashib, magnit maydon kuchaygan sari, zarralar kapillyarning yuqori yuzasiga qarab harakat qilganda zarracha zanjirlari qisqardi (Qo'shimcha video S1 ga qarang). : MP4), sirtdagi zarrachalar zichligini oshirish.Aksincha, magnit kapillyardan chiqarilganda, maydon kuchi kamayadi va MPlar kapillyarning yuqori yuzasidan cho'zilgan uzun zanjirlarga joylashadi (Qo'shimcha video S2: MP4 ga qarang).Magnit harakatni to'xtatgandan so'ng, zarralar muvozanat holatiga kelgandan keyin bir muncha vaqt harakat qilishda davom etadi.MP kapillyarning yuqori yuzasiga qarab va undan uzoqlashganda, magnit zarralar suyuqlik orqali qoldiqlarni tortib olishga intiladi.
PCXI ostida MP ko'rinishi namunalar orasida sezilarli darajada farq qiladi.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 va (d) MP6.Bu erda ko'rsatilgan barcha tasvirlar to'g'ridan-to'g'ri kapillyardan taxminan 10 mm yuqorida joylashgan magnit bilan olingan.Ko'rinib turgan katta doiralar kapillyarlarda tutilgan havo pufakchalari bo'lib, faza kontrasti tasvirining qora va oq chekka xususiyatlarini aniq ko'rsatadi.Qizil quti kontrastni kuchaytiradigan kattalashtirishni bildiradi.E'tibor bering, barcha raqamlardagi magnit zanjirlarning diametrlari masshtabga mos kelmaydi va ko'rsatilgandan taxminan 100 baravar katta.
Magnit kapillyarning yuqori qismi bo'ylab chapga va o'ngga siljiganida, MP ipining burchagi magnit bilan moslashish uchun o'zgaradi (6-rasmga qarang), shuning uchun magnit maydon chiziqlari aniqlanadi.MP3-5 uchun akkord chegara burchagiga yetgandan so'ng, zarralar kapillyarning yuqori yuzasi bo'ylab harakatlanadi.Bu ko'pincha deputatlarning magnit maydon eng kuchli bo'lgan joyda katta guruhlarga to'planishiga olib keladi (Qo'shimcha video S3: MP5 ga qarang).Bu, ayniqsa, kapillyarning oxiriga yaqin tasvirni olishda ham yaqqol namoyon bo'ladi, bu esa MP ning suyuqlik-havo interfeysida to'planishiga va konsentratsiyasiga olib keladi.MP3-5 ga qaraganda farqlash qiyinroq bo'lgan MP6 zarralari magnit kapillyar bo'ylab harakatlanayotganda sudralib ketmadi, lekin MP torlari ajralib chiqib, zarrachalarni ko'rinishda qoldirdi (Qo'shimcha video S4: MP6ga qarang).Ba'zi hollarda, magnitni tasvirlash joyidan uzoq masofaga siljitish orqali qo'llaniladigan magnit maydon kamaytirilganda, qolgan barcha MPlar tortishish kuchi bilan sekin trubaning pastki yuzasiga tushib, ipda qoladilar (Qo'shimcha video S5: MP3 ga qarang) .
Magnit kapillyar ustidagi o'ngga harakat qilganda MP ipining burchagi o'zgaradi.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 va (d) MP6.Qizil quti kontrastni kuchaytiradigan kattalashtirishni bildiradi.Shuni esda tutingki, qo'shimcha videolar ma'lumot olish uchun mo'ljallangan, chunki ular muhim zarrachalar tuzilishi va dinamik ma'lumotlarni ochib beradi, ularni ushbu statik tasvirlarda tasvirlab bo'lmaydi.
Bizning sinovlarimiz shuni ko'rsatdiki, magnitni traxeya bo'ylab asta-sekin oldinga va orqaga siljitish in vivo jonli ravishda murakkab harakat kontekstida MFni vizualizatsiya qilishni osonlashtiradi.In vivo sinovlari o'tkazilmadi, chunki polistirol boncuklar (MP1 va MP2) kapillyarda ko'rinmas edi.Qolgan to'rtta MFning har biri magnitning uzun o'qi traxeya ustida vertikalga taxminan 30 ° burchak ostida joylashtirilgan holda in vivo sinovdan o'tkazildi (2b va 3a-rasmlarga qarang), chunki bu uzunroq MF zanjirlariga olib keldi va samaraliroq bo'ldi. magnitdan ko'ra..konfiguratsiya tugatildi.MP3, MP4 va MP6 jonli hayvonlarning traxeyalarida topilmadi.Hayvonlarni insoniy ravishda o'ldirgandan so'ng, kalamushlarning nafas olish yo'llarini ko'rishda, shpritsli nasos yordamida qo'shimcha hajm qo'shganda ham zarralar ko'rinmas bo'lib qoldi.MP5 eng yuqori temir oksidi tarkibiga ega edi va yagona ko'rinadigan zarracha edi, shuning uchun u MP harakatini in vivo baholash va tavsiflash uchun ishlatilgan.
MFni kiritish vaqtida magnitni traxeya ustiga qo'yish ko'p MF larning hammasi emas, balki ko'rish maydonida to'planishiga olib keldi.Zarrachalarning traxeyaga kirishi eng yaxshi inson tomonidan evtanizatsiya qilingan hayvonlarda kuzatiladi.7-rasm va qo'shimcha video S6: MP5 ventral traxeya yuzasida zarrachalarning tezkor magnit ushlanishi va hizalanishini ko'rsatadi, bu esa deputatlar traxeyaning kerakli joylariga yo'naltirilishi mumkinligini ko'rsatadi.MF yuborilgandan so'ng traxeya bo'ylab ko'proq distalni qidirganda, ba'zi MFlar karinaga yaqinroq topildi, bu barcha MFlarni to'plash va ushlab turish uchun magnit maydon kuchining etarli emasligini ko'rsatadi, chunki ular suyuqlikni kiritish paytida maksimal magnit maydon kuchi mintaqasi orqali etkazib berilgan.jarayon.Biroq, tug'ruqdan keyingi MP kontsentratsiyasi tasvir maydoni atrofida yuqoriroq bo'lgan, bu ko'plab deputatlar qo'llaniladigan magnit maydon kuchi eng yuqori bo'lgan havo yo'llari hududlarida qolganligini ko'rsatadi.
MP5 ni yaqinda evtanizatsiya qilingan kalamushning traxeyasiga yuborishdan oldin (a) va (b) tasvirlash maydonining tepasida joylashgan magnit bilan tasvirlar.Tasvirlangan maydon ikkita xaftaga tushadigan halqalar orasida joylashgan.MP etkazib berishdan oldin havo yo'llarida suyuqlik bor.Qizil quti kontrastni kuchaytiradigan kattalashtirishni bildiradi.Ushbu tasvirlar S6: MP5 qo'shimcha videosida taqdim etilgan videodan olingan.
Magnitni traxeya bo'ylab in vivo jonli ravishda siljitish kapillyarlarda kuzatilganga o'xshash havo yo'llari yuzasida MP zanjirining burchagi o'zgarishiga olib keldi (8-rasm va qo'shimcha video S7: MP5ga qarang).Biroq, bizning tadqiqotimizda deputatlarni kapillyarlar kabi tirik nafas yo'llarining yuzasi bo'ylab sudrab bo'lmaydi.Ba'zi hollarda, magnit chapga va o'ngga harakat qilganda, MP zanjiri uzayadi.Qizig'i shundaki, biz zarrachalar zanjiri magnit traxeya bo'ylab uzunlamasına harakatlantirilganda suyuqlikning sirt qatlamining chuqurligini o'zgartirishini va magnitni to'g'ridan-to'g'ri tepaga siljitganda va zarrachalar zanjiri vertikal holatga aylantirilganda kengayishini aniqladik (qarang. Qo'shimcha video S7).: MP5 0:09, pastki o'ng).Magnit traxeyaning yuqori qismi bo'ylab (ya'ni, traxeya uzunligi bo'ylab emas, balki hayvonning chap yoki o'ng tomoniga) lateral harakatlantirilganda xarakterli harakat shakli o'zgardi.Zarrachalar harakati davomida hali ham aniq ko'rinib turardi, lekin magnit traxeyadan chiqarilganda, zarrachalar iplarining uchlari ko'rinib qoldi (Qo'shimcha video S8: MP5, 0:08 dan boshlab qarang).Bu shisha kapillyarda qo'llaniladigan magnit maydon ta'sirida magnit maydonning kuzatilgan harakati bilan mos keladi.
Jonli behushlik qilingan kalamushning traxeyasida MP5 ni ko'rsatadigan namunali rasmlar.(a) Magnit traxeyaning yuqori va chap tomonidagi tasvirlarni olish uchun ishlatiladi, keyin (b) magnitni o'ngga siljitgandan keyin.Qizil quti kontrastni kuchaytiradigan kattalashtirishni bildiradi.Ushbu tasvirlar S7-ning qo'shimcha videosida taqdim etilgan videodan olingan: MP5.
Ikki qutb traxeyaning tepasida va ostidan shimoldan janubga qarab sozlanganda (ya'ni, tortishish; 3b-rasm) MP akkordlari uzunroq paydo bo'lib, traxeyaning dorsal yuzasida emas, balki uning lateral devorida joylashgan edi. traxeya (Ilovaga qarang).Video S9: MP5).Biroq, bir joyda (ya'ni, traxeya dorsal yuzasi) zarrachalar yuqori konsentrasiyalari odatda bitta magnit qurilma bilan sodir ikki magnitlangan qurilma yordamida suyuqlik ma'muriyati so'ng aniqlanmadi.Keyin, bitta magnit qarama-qarshi qutblarni qaytarish uchun tuzilganida (3c-rasm), etkazib berishdan keyin ko'rish sohasida ko'rinadigan zarrachalar soni ko'paymadi.Ikkala magnit konfiguratsiyasini o'rnatish magnitlarni o'ziga tortadigan yoki itaruvchi yuqori magnit maydon kuchi tufayli qiyin.Keyin o'rnatish havo yo'llariga parallel bo'lgan, lekin 90 graduslik burchak ostida havo yo'llari orqali o'tadigan yagona magnitga o'zgartirildi, shunda kuch chiziqlari traxeya devorini ortogonal ravishda kesib o'tdi (3d-rasm), bu yo'nalishda zarrachalarning to'planish ehtimolini aniqlash uchun mo'ljallangan. lateral devor.kuzatilishi kerak.Biroq, ushbu konfiguratsiyada aniqlangan MF to'planish harakati yoki magnit harakati yo'q edi.Ushbu natijalarning barchasiga asoslanib, gen tashuvchilarning in vivo tadqiqotlari uchun bitta magnit va 30 graduslik yo'nalishga ega konfiguratsiya tanlandi (3a-rasm).
Hayvon inson tomonidan qurbon qilinganidan so'ng darhol bir necha marta suratga olinganda, to'qimalar harakatining to'sqinlik qilmasligi aniq xaftaga oid sohada magnitning tarjima harakatiga mos ravishda "chayqalayotgan" nozikroq, qisqaroq zarracha chiziqlarini aniqlash mumkinligini anglatadi.MP6 zarralarining mavjudligi va harakatini aniq ko'ring.
LV-LacZ titri 1,8 x 108 IU/ml ni tashkil etdi va CombiMag MP (MP6) bilan 1:1 aralashtirilgandan so'ng hayvonlarga 50 µl traxeya dozasi 9 x 107 IU/ml LV vosita (ya'ni 4,5) yuborildi. x 106 TU/kalamush).).).Ushbu tadqiqotlarda, tug'ruq paytida magnitni harakatlantirish o'rniga, biz magnit maydonning yo'qligida LV transduktsiyasini (a) vektor uzatish bilan solishtirganda yaxshilash mumkinmi yoki yo'qligini aniqlash uchun magnitni bir holatda o'rnatdik va (b) havo yo'li. diqqat markazida bo'lish.Yuqori nafas yo'llarining magnit maqsadli hududlarida transduktsiya qilingan hujayralar.
Magnitlarning mavjudligi va CombiMag-ni LV vektorlari bilan birgalikda ishlatish, bizning standart LV vektorini etkazib berish protokolimiz kabi hayvonlarning sog'lig'iga salbiy ta'sir ko'rsatmadi.Mexanik buzilishlarga duchor bo'lgan traxeya hududining frontal tasvirlari (1-qo'shimcha rasm) LV-MP bilan davolash qilingan guruh magnit mavjudligida transdüksiyaning sezilarli darajada yuqori ekanligini ko'rsatdi (9a-rasm).Nazorat guruhida faqat oz miqdorda ko'k LacZ bo'yalgan edi (9b-rasm).X-Gal bilan bo'yalgan normallashtirilgan hududlarning miqdorini aniqlash LV-MP ni magnit maydon mavjudligida qo'llash taxminan 6 marta yaxshilanishini ko'rsatdi (9c-rasm).
LV-MP (a) magnit maydon mavjudligida va (b) magnit yo'qligida trakeal transduktsiyani ko'rsatadigan kompozit tasvirlar misoli.(c) Magnit yordamida traxeyada LacZ transduktsiyasining normallashtirilgan maydonida statistik jihatdan sezilarli yaxshilanish (*p = 0,029, t-test, har bir guruh uchun n = 3, o'rtacha ± standart xato).
Neytral tez qizil bo'yalgan qismlar (qo'shimcha 2-rasmda ko'rsatilgan misol) LacZ bilan bo'yalgan hujayralar bir xil namunada va ilgari xabar qilingan joyda mavjudligini ko'rsatdi.
Nafas olish yo'llarining gen terapiyasidagi asosiy muammo - tashuvchi zarralarni qiziqtiradigan sohalarda aniq lokalizatsiya qilish va havo oqimi va faol shilimshiq klirensi mavjud bo'lgan mobil o'pkada transduksiya samaradorligining yuqori darajasiga erishish.Kistik fibrozda nafas olish kasalliklarini davolash uchun mo'ljallangan LV tashuvchilar uchun tashuvchi zarrachalarning o'tkazuvchan havo yo'llarida qolish vaqtini oshirish shu paytgacha erishib bo'lmaydigan maqsad bo'lib kelgan.Castellani va boshqalar tomonidan ta'kidlanganidek, transduksiyani kuchaytirish uchun magnit maydonlardan foydalanish elektroporatsiya kabi boshqa genlarni etkazib berish usullariga nisbatan afzalliklarga ega, chunki u soddalik, tejamkorlik, mahalliy etkazib berish, samaradorlikni oshirish va inkubatsiya vaqtini qisqartirishi mumkin.va, ehtimol, transport vositasining past dozasi10.Biroq, tashqi magnit kuchlar ta'sirida nafas yo'llarida magnit zarrachalarning in vivo cho'kishi va xatti-harakati hech qachon tasvirlanmagan va aslida bu usulning buzilmagan tirik havo yo'llarida genlarni ifodalash darajasini oshirish qobiliyati in vivo ko'rsatilmagan.
PCXI sinxrotronidagi in vitro tajribalarimiz shuni ko'rsatdiki, biz sinovdan o'tkazgan barcha zarralar, MP polistiroldan tashqari, biz ishlatgan tasvirni o'rnatishda ko'rinadi.Magnit maydon mavjud bo'lganda, magnit maydonlar uzunligi zarrachalar turiga va magnit maydonning kuchiga (ya'ni, magnitning yaqinligi va harakati) bog'liq bo'lgan iplarni hosil qiladi.10-rasmda ko'rsatilganidek, biz kuzatayotgan iplar har bir alohida zarracha magnitlangan bo'lib, o'zining mahalliy magnit maydonini induktsiya qilganda hosil bo'ladi.Bu alohida maydonlar boshqa shunga o'xshash zarrachalarni to'plash va boshqa zarralarni mahalliy tortish va itarish kuchlarining mahalliy kuchlari tufayli guruh torlari harakati bilan bog'lanishiga olib keladi.
Diagrammada (a, b) suyuqlik bilan to'ldirilgan kapillyarlar va (c, d) havo bilan to'ldirilgan traxeya ichida hosil bo'lgan zarrachalar zanjiri.E'tibor bering, kapillyarlar va traxeya o'lchovga tortilmaydi.Panel (a) shuningdek, zanjirlarda joylashgan Fe3O4 zarralarini o'z ichiga olgan MF tavsifini o'z ichiga oladi.
Magnit kapillyar ustida harakat qilganda, zarrachalar ipining burchagi Fe3O4 ni o'z ichiga olgan MP3-5 uchun kritik chegaraga yetdi, shundan so'ng zarrachalar ipi endi asl holatida qolmadi, balki sirt bo'ylab yangi holatga o'tdi.magnit.Bu ta'sir shisha kapillyar yuzasi bu harakatni amalga oshirish uchun etarlicha silliq bo'lganligi sababli yuzaga keladi.Qizig'i shundaki, MP6 (CombiMag) bunday yo'l tutmadi, ehtimol zarrachalar kichikroq bo'lganligi, boshqa qoplama yoki sirt zaryadiga ega bo'lganligi yoki mulkiy tashuvchi suyuqlik ularning harakat qilish qobiliyatiga ta'sir qilgani uchun.CombiMag zarracha tasviridagi kontrast ham zaifroq, bu suyuqlik va zarrachalar bir xil zichlikka ega bo'lishi mumkinligini va shuning uchun bir-biriga osongina harakat qila olmasligini ko'rsatadi.Agar magnit juda tez harakat qilsa, zarrachalar ham tiqilib qolishi mumkin, bu esa magnit maydon kuchi suyuqlikdagi zarrachalar orasidagi ishqalanishni har doim ham engib o'ta olmasligini ko'rsatadi, bu esa magnit maydon kuchi va magnit bilan maqsadli maydon o'rtasidagi masofani ko'rsatmasligi kerak. ajablanib.muhim.Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, magnitlar maqsadli hududdan oqib o'tadigan ko'plab mikrozarralarni ushlay olsa ham, CombiMag zarralarini traxeya yuzasi bo'ylab harakatlantirish uchun magnitlarga ishonish mumkin emas.Shunday qilib, biz in vivo LV MF tadqiqotlarida havo yo'llari daraxtining muayyan joylarini jismoniy maqsadli ravishda nishonga olish uchun statik magnit maydonlardan foydalanish kerak degan xulosaga keldik.
Zarrachalar tanaga etkazilgandan so'ng, ularni tananing murakkab harakatlanuvchi to'qimalari kontekstida aniqlash qiyin, biroq ularni aniqlash qobiliyati magnitni traxeya bo'ylab gorizontal ravishda MP torlarini "silkitish" uchun harakatlantirish orqali yaxshilandi.Haqiqiy vaqtda tasvirlash mumkin bo'lsa-da, hayvon inson tomonidan o'ldirilganidan keyin zarrachalar harakatini aniqlash osonroq.MP kontsentratsiyasi odatda magnit ko'rish maydoniga joylashtirilganida eng yuqori bo'lgan, ammo ba'zi zarralar odatda traxeyadan pastroqda topilgan.In vitro tadqiqotlaridan farqli o'laroq, zarrachalarni magnit harakati bilan traxeyaga tortib bo'lmaydi.Bu topilma traxeya sirtini qoplaydigan shilliq odatda inhaler zarralarni qanday qayta ishlagani, ularni shilimshiqda ushlab turishi va keyinchalik ularni shilliq qavatni tozalash mexanizmi orqali tozalashiga mos keladi.
Biz tortishish uchun traxeya ustidagi va ostidagi magnitlardan foydalanish (3b-rasm) bir nuqtada yuqori konsentratsiyali magnit maydonni emas, balki bir xil magnit maydonni keltirib chiqarishi mumkinligini taxmin qildik, bu esa zarrachalarning yanada bir xil taqsimlanishiga olib kelishi mumkin..Biroq, bizning dastlabki tadqiqotimiz ushbu farazni tasdiqlovchi aniq dalillarni topa olmadi.Xuddi shunday, bir juft magnitni qaytarish uchun o'rnatish (3c-rasm) tasvir maydonida zarrachalarning ko'proq joylashishiga olib kelmadi.Ushbu ikkita topilma shuni ko'rsatadiki, qo'sh magnitli o'rnatish MP ishorasining mahalliy boshqaruvini sezilarli darajada yaxshilamaydi va natijada paydo bo'lgan kuchli magnit kuchlarni sozlash qiyin, bu yondashuvni kamroq amaliy qiladi.Xuddi shunday, magnitni traxeyaning tepasida va bo'ylab yo'naltirish (3d-rasm) ham tasvirlangan maydonda qolgan zarrachalar sonini ko'paytirmadi.Ushbu muqobil konfiguratsiyalarning ba'zilari muvaffaqiyatli bo'lmasligi mumkin, chunki ular cho'kma zonasida magnit maydon kuchining pasayishiga olib keladi.Shunday qilib, 30 gradusdagi yagona magnit konfiguratsiyasi (3a-rasm) eng oddiy va eng samarali in vivo sinov usuli hisoblanadi.
LV-MP tadqiqoti shuni ko'rsatdiki, LV vektorlari CombiMag bilan birlashtirilganda va magnit maydon mavjudligida jismoniy bezovta qilinganidan keyin etkazib berilganda, traxeyada transduksiya darajasi nazorat bilan solishtirganda sezilarli darajada oshgan.Sinxrotron ko'rish tadqiqotlari va LacZ natijalariga ko'ra, magnit maydon LVni traxeyada ushlab turishi va darhol o'pkaga chuqur kirib boradigan vektor zarralari sonini kamaytirishi mumkin edi.Bunday maqsadli yaxshilanishlar yuqori samaradorlikka olib kelishi mumkin, shu bilan birga etkazib beriladigan titrlarni, maqsadli bo'lmagan transduktsiyani, yallig'lanish va immun yon ta'sirini va genlarni uzatish xarajatlarini kamaytiradi.Muhimi, ishlab chiqaruvchiga ko'ra, CombiMag boshqa genlarni uzatish usullari, jumladan, boshqa virusli vektorlar (masalan, AAV) va nuklein kislotalar bilan birgalikda ishlatilishi mumkin.